Calmodulin (רמ"א) הנפתח assay היא דרך יעילה לחקור את האינטראקציה של CAM עם חלבונים שונים. שיטה זו משתמשת Cam-sepharose חרוזים לצורך ניתוח יעיל ספציפי של Cam-binding חלבונים. זה מספק כלי חשוב לחקור איתות קאם פונקציה הסלולר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
סידן (Ca 2 +) הוא יון חיוני בוויסות תפקוד הסלולר באמצעות מגוון של מנגנונים. הרבה Ca 2 + איתות מתווכת באמצעות חלבון וסידן מחייב המכונה 1,2 (רמ"א) calmodulin. CAM הוא מעורב במספר רמות כמעט בכל תהליכים תאיים, כולל אפופטוזיס, חילוף החומרים, התכווצות שרירים חלקים, הפלסטיות הסינפטית, צמיחה עצב, דלקת את התגובה החיסונית. מספר חלבונים מסייעים לווסת מסלולים אלו באמצעות האינטראקציה שלהם עם קאם. רבים אינטראקציות אלה תלויים קונפורמציה של CAM, השונה במובהק כאשר חייב Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) בניגוד למצב Ca 2 +-free שלה (ApoCaM) 3.
בעוד שרוב החלבונים היעד לאגד Ca 2 +-CAM, חלבונים מסוימים רק לאגד ApoCaM. חלק CAM לאגד דרך תחום IQ שלהם, כולל 4 neuromodulin, neurogranin (נג) 5, ו myosins מסוימים 7, פונקציה postsynaptic 8, 9 ו - התכווצות שרירים, בהתאמה. יכולתם לקשור ולשחרר CAM בהעדר או נוכחות של Ca 2 + הוא מכריע את תפקידם. לעומת זאת, חלבונים רבים רק לאגד Ca 2 +-CAM ודורשים זה מחייב הפעלה שלהם. דוגמאות כוללות שרירן קינאז שרשרת אור 10, Ca 2 + / CAM תלויי קינאז (CaMKs) 11 ו phosphatases (למשל calcineurin) 12, 13 ו spectrin קינאז, אשר יש מגוון של השפעות ישירות או במורד 14.
ההשפעות של חלבונים אלה על תפקוד הסלולר הם בדרך כלל תלויה ביכולתם להיקשר CAM באופן + תלויות Ca 2. לדוגמה, בדקנו את הרלוונטיות של הכריכה NG-CAM בתפקוד סינפטי וכיצד מוטציות שונות משפיעות זו מחייבת. אנחנו שנוצר קון GFP-tagged נגstruct עם מוטציות ספציפיות בתחום-IQ כי תשנה את יכולתו של נג להיקשר CAM באופן + תלויות Ca 2. המחקר של אלה מוטציות שונות נתנו לנו לרדת לעומקה של תהליכים חשובים מעורב בתפקוד סינפטי 8,15. עם זאת, מחקרים כאלה, חיוני להוכיח כי החלבונים מוטציה יש מחייב שינוי צפוי CAM.
כאן, אנו מציגים שיטה לבדיקת יכולתה של חלבונים להיקשר קאם נוכחות או היעדר של Ca 2 +, באמצעות CaMKII ו נג כדוגמאות. שיטה זו היא סוג של זיקה כרומטוגרפיה המכונה assay CAM הנפתח. היא משתמשת Cam-Sepharose חרוזים לבדוק חלבונים הנקשרים CAM ואת ההשפעה של Ca 2 + על זה מחייב. זה הזמן הרבה יותר יעיל דורש פחות חלבון ביחס כרומטוגרפיה בעמודה מבחני אחרות. בסך הכל, זה מספק כלי רב ערך כדי לחקור Ca 2 + / CAM איתות וחלבונים כיteract עם קאם.
פרוטוקול
עיין באיור 1 עבור סכמטית בסיסית של תחילת ההליך עם homogenate. זמן משוער של הכנת תמציות הסלולר elution של רמ"א הנכנס חלבונים הוא כ 6-7 שעות.
1. רקמות הכנה
- הזרק פרוסות בהיפוקמפוס organotypic בווירוס המכיל פלסמיד ביטוי חלבון רקומביננטי של עניין (בדוגמה זו, ירוק ניאון (GFP), מתויג חלבון נג) ולאפשר רקמות לבטא חלבון לילה.
- כ 12 עד 18 שעות לאחר ההזרקה ויראלי (תלוי בזמן ביטוי ויראלי), להכין לאסוף את הרקמה. הוסף חוצץ לנתיחה 1mL (גל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול בתנאי מנצל Cam-sepharose חרוזים לחקור את Ca 2 +-התלות של Cam-binding חלבונים. חלבונים רבים לאגד CAM באופן + תלויות Ca 2. אינטראקציות אלה הם בעלי חשיבות רבה בהתחשב במספר CAM מחייב חלבונים תפקיד קריטי שלהם מסלולי איתות רבים. בפרוטוקול זה, Cam-sepharose חרוזים משמשים נפרד CAM מחייב חלבונים מן homogenate רקמות נוכחות או היעדר של Ca 2 +. התוצאות של הגישה הזאת פשוט יהיה עוד יותר את ההבנה של איך חלבונים עשויה ליצור אינטראקציה עם קאם בצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
המחברים מבקשים להודות טיפאני שרי עזרתה אופטימיזציה בפרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי להזדקנות (AG032320), כמו גם קידום ויסקונסין בריא.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| מוצר | חברה | מספר קטלוגי | הערות |
| Calmodulin-Sepharose חרוזים | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII אלפא | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | Millipore | 07-425 | |
| טוען ג'ל Pipet טיפים | דיג | 02-707-138 | השתמש השאיפה של supernatants |
| Microcentrifuge צינורות (2.0 מ"ל) | דיג | 05-408-146 | השתמש עבור כל השלבים הכרוכים calmodulin-sepharose חרוזים |
מקורות
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
