تحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات

Summary

نحن وصف مجموعة من فحوصات لتحليل مستويات التعبير من histones رابط H1. يتم قياسها كميا مرنا من الجينات H1 الفردية العشوائية النسخ العكسي التمهيدي استنادا تليها في الوقت الحقيقي PCR، في حين يتم تحقيق الكمي من البروتين histones H1 بواسطة تحليل HPLC.

Abstract

H1 هيستون رابط بربط الجسيمات الأساسية النيوكليوسومات والحمض النووي رابط، وتسهيل للطي من لونين إلى أعلى هيكل النظام. H1 أمر أساسي للتنمية الثدييات ⁽¹⁾ وينظم محددة التعبير الجيني في الجسم الحي ^2-4. بين البروتينات هيستون حفظا للغاية، والأسرة من histones رابط H1 هي مجموعة غير متجانسة أكثر. وهناك أنواع فرعية H1 11 في الثدييات التي تنظم بشكل مختلف خلال التنمية وأنواع مختلفة من الخلايا. هذه الأنواع الفرعية H1 منها 5 جسدية H1S (H1A الإلكترونية)، واستبدال H1 ^0، 4 جرثومة فرعية الخلية H1 محددة، وH1x ^5. وجود أنواع فرعية H1 المتعددة التي تختلف في تقارب الحمض النووي ملزم لونين وقدرة الضغط ^6-9 توفر مستوى إضافي من تعديل وظيفة من لونين. وبالتالي، التحليل الكمي التعبير عن الأنواع الفرعية H1 الفردية، وكلاهما من مرنا والبروتينات، أمر ضروري لفهم أفضل للتنظيم العاليترتيب هيكل لونين وظيفة.

نحن هنا وصف مجموعة من فحوصات تهدف لتحليل مستويات التعبير عن الأنواع الفرعية H1 الفردية (الشكل 1). ويتم قياس التعبير مرنا من مختلف الجينات البديل H1 من قبل مجموعة من حساسة للغاية وكمية النسخ المقايسات-PCR (qRT-PCR) العكسي، والتي هي أسرع وأكثر دقة وتتطلب عينات أقل بكثير بالمقارنة مع نهج بديل من تحليل لطخة الشمالية. وخلافا لمعظم غيرها من الرسائل الخلوية مرنا، mRNAs للجينات معظم هيستون، بما في ذلك غالبية الجينات H1، تفتقر إلى ذيل polyA طويل، ولكنها تحتوي على بنية الجذعية حلقة في المنطقة 3 'غير مترجمة (UTR) ^10. لذلك، يتم إعداد cDNAs من مجموع بواسطة الحمض النووي الريبي النسخ العكسي باستخدام البادئات العشوائية بدلا من بنسبة ضئيلة من DT الاشعال. وتجرى فحوصات PCR الوقت الحقيقي مع الاشعال الخاصة بكل أنواع فرعية H1 (الجدول 1) للحصول على القياس الكمي للغاية من مستويات مرنا من النوع الفرعي H1 الفرديةق. ويتم تحليل التعبير عن الجينات التدبير المنزلي وضوابط للتطبيع.

يتم الحصول على الوفرة النسبية للبروتينات من كل سلالة H1 و histones الأساسية من خلال عكس اللوني المرحلة السائلة عالية الأداء (RP-HPLC) تحليل histones مجموع المستخرج من خلايا الثدييات ^11-13. ووصف طريقة HPLC وشروط منح شطف هنا فصل الأمثل من أنواع فرعية H1 الماوس. عن طريق قياس الشخصية HPLC، قمنا بحساب الحصة النسبية من أنواع فرعية H1 الفردية داخل الأسرة H1، وكذلك تحديد من H1 إلى نسبة النيوكليوسومات في الخلايا.

Protocol

1. إعداد العينات واستخلاص الحمض النووي الريبي

1. قبل استخراج الحمض النووي الريبي، ينبغي أن تزول جميع أسطح العمل والماصات مع الايثانول 70٪ وتعامل مع حل تطهير ريبونوكلياز، مثل زاب ريبونوكلياز. هذه الممارسة يقلل من فرص التلوث والتدهور ريبونوكلياز الحمض النووي الريبي. ارتداء القفازات لجميع الإجراءات.
2. لاستخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة الماوس، وتشريح الجهاز من الاهتمام من الماوس الموت الرحيم، وغسل الفوسفات في الأنسجة الجليد الباردة مخزنة المالحة (بى بى سى: 0.13 م كلوريد الصوديوم، و 5 فوسفات ا....

Discussion

قدمت مجموعة من فحوصات هنا تمكين تحليل شامل لمستويات التعبير عن الأنواع الفرعية الثدييات هيستون رابط. صمم بشكل صحيح qRT-PCR المقايسات توفير قياسات حساسة للغاية ودقيقة من الرسائل من أي جينات الحمض النووي الريبي هيستون H1 الثدييات. وجزء هام من qRT-PCR المقايسات لرابط جينات سلالة هيستون هو إعداد [كدنا] باستخدام التمهيدي عشوائي استنادا النسخ العكسي. مرنا من الجينات معظم هيستون، بما في ذلك معظم جينات H1، لا تحتوي على فترة طويلة بولي ذيل المقدمة في mRNAs الخلوية الأخرى. وبالتالي فإن الطر.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
ريبونوكلياز زاب	النظم البيولوجية التطبيقية	AM9780
Trizol الكاشف	إينفيتروجن	15596-018
SuperScriptIII	إينفيتروجن	18080-051
مطلق الايثانول	فيشر العلمية	BP2818-4
IQ SYBR الأخضر	الحيوي راد	170-8880
RNeasy البسيطة كيت	QIAGEN	74104
ديوكسي ريبونيوكلياز أنا	سيغما	AMP-D1
Microseal 96-جيدا لوحة PCR	الحيوي راد	MSP-9605
'ب' Microseal الأختام لاصق	الحيوي راد	MSB-1001
سكر القصب	شركة Agros العضوية	AC40594
heptahydrate ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4 · 7H 2 O)	فيشر العلمية	BP332
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	الأمريكي Bioanalytical	AB01915
heptahydrate فوسفات الصوديوم هيدروجين (ناه 2 PO 4 · 7H2O)	فيشر العلمية	BP-330
HEPES	فيشر العلمية	BP310
كاملة المانع بروتين صغير كوكتيل قرص	روش العلوم التطبيقية	11836153001
EDTA	سيغما	E-5134
فلوريد Phenylmethanesulfonyl (PMSF)	الأمريكي Bioanalytical	AB01620
Nonidet-40 (NP-40)	الأمريكي Bioanalytical	AB01425
كلوريد البوتاسيوم (بوكل)	فيشر العلمية	BP366
تريس [aminomethane hydroxymethyl]	الأمريكي Bioanalytical	AB02000
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)	فيشر العلمية	BP214
حامض الكبريتيك (H2SO4)	VWR	VW3648-3
هيدروكسيد الأمونيوم (NH 4 OH)	شركة Agros العضوية	AC42330
برادفورد البروتين الفحص	الحيوي راد	500-0001
الأسيتونيتريل	EMD	AX0145-1
Trifluoroacetic حامض (TFA)	JTBaker	9470-01