Прогрессивная процедура колонизации описывается для дальнейшей оценки его влияния на метаболизм печеночных хоста. Колонизация контролируется, не invasively путем оценки экскреции микробных метаболитов совместного с помощью ЯМР основе метаболических профилей в то время как печеночный метаболизм оценивается Высокое разрешение магического угла Спиннинг (HR MAS) ЯМР профилирования интактных биопсии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка изменения Печеночная Метаболический Во Прогрессивная Колонизация зародыш без мыши по 1 Н-ЯМР-спектроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хорошо известно, что кишечные бактерии вносят значительный вклад в гомеостаз организма хозяина, обеспечивая ряд преимуществ, таких как иммунная защита и синтез витаминов. Они также снабжают хозяина значительным количеством питательных веществ, что делает эту экосистему важным метаболическим органом. В контексте растущего числа доказательств связи между кишечной флорой и метаболическим синдромом понимание метаболического взаимодействия между организмом хозяина и его кишечной микробиотой становится важной задачей современной биологии.1-4
Колонизация (также называемая процессом нормализации) представляет собой заселение микроорганизмами ранее безмикробного животного. Хотя это естественный процесс, происходящий при рождении, он также применяется у взрослых безмикробных животных для контроля экосистемы кишечной флоры и последующего определения ее влияния на метаболизм хозяина. Распространенным методом контроля процесса колонизации является зондовое введение (гаваж) одного вида или смеси микроорганизмов. Этот метод приводит к очень быстрой колонизации, но имеет недостаток в виде чрезвычайно высокого уровня стресса5. Поэтому целесообразно минимизировать стресс и обеспечить более медленный процесс колонизации, чтобы постепенно наблюдать за влиянием заселения бактерий на метаболизм хозяина.
В данной работе мы описываем процедуру оценки модификации печеночного метаболизма в процессе постепенной колонизации с использованием неразрушающего метода метаболического профилирования. Мы предлагаем осуществлять мониторинг колонизации кишечника микробиотой путем оценки метаболической активности кишечных микробов, которая отражается в экскреции с мочой микробных кометаболитов, с помощью метаболического профилирования на основе 1H ЯМР. Это позволяет оценить стабильность активности кишечной микробиоты помимо стабильного установления экосистемы кишечника, которое обычно оценивается путем мониторинга фекальных бактерий с помощью DGGE (электрофореза в денатурирующем градиентном геле).6 Колонизация происходит в обычной открытой среде и инициируется загрязненным наполнителем от обычных животных, которые будут служить контрольной группой. Поскольку грызуны являются копрофагами, это обеспечивает гомогенную колонизацию, как было описано ранее.7
Метаболический профиль печени измеряется непосредственно в интактном биоптате печени с помощью 1H ЯМР-спектроскопии высокого разрешения с магическим углом вращения (MAS NMR). Этот полуколичественный метод позволяет быстро оценить основные метаболиты, такие как триглицериды, глюкоза и гликоген, не повреждая структуру клеток, чтобы в дальнейшем оценить сложное взаимодействие между процессом колонизации и метаболизмом в печени7-10. Данный метод может быть применен к биоптату любой ткани11,12.
Протокол
1. Колонизация неинфицированных животных и отбора образцов
- Удалить неинфицированных животных из изоляторов и их размещение в обычной комнате хозяйства в клетках, оборудованных фильтром перед обычных животных, которые будут служить в качестве контроля (рис. 1).
- Смешайте половину помета (3 дней), взятые из-под контроля обычных клетку с пометом неинфицированных животных. Всегда держите 1 / 3 от обычной грязной мусор каждый раз надо продлевать его, чтобы поддерживать уровень бактерий (держать его по крайней мере в течение 3 дней).
- Сбор мочи в 1,5 мл микропробирок путем обработки мыши над трубой и помочь мочеиспускания, осторожно массаж кише....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе, мы описали прогрессивные процедуры колонизации в открытую среду для дальнейшего изучения воздействия микрофлоры кишечника на печеночный метаболизм оценивается 1 H HR MAS ЯМР профилирования интактных биопсии. Различные методы колонизации были описаны в литературе. Наиболее распространенные методы, чтобы колонизировать животных с определенной микрофлоры являются устные зонд или загрязненной питьевой воды, 19,20. Фекальные прививки также могут быть использованы, как описано выше
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Все спектров ЯМР используется в качестве иллюстративных примеров взяты из ранее опубликованных исследований 7, которая выполнена при финансовой поддержке компании Nestle.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Таблица специфических реагентов и оборудования:
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| 2,5 мм микропробирок | Новая эра | NE-H5/2.5-V-Br | |
| 1,7 мм капиллярная трубка | Sigma-Aldrich | NORS175001 | |
| Капиллярная адаптер | Новая эра | NE-325-5/1.7 | |
| Добыча стержень | Новая эра | NE-341-5 | |
| HR-MAS ротора BL4 с 50 мкл сферической Spacer тефлоновым комплект | Bruker | HZ07213 | |
| Набор для 50 мкл вставками | Bruker | B2950 | |
| Advance III 600МГц ЯМР | Bruker | ||
| 1 H HR MAS ЯМР твердого штыря | Bruker | ||
| Оксид дейтерия 99,9% | Sigma-Aldrich | 530 867-1L | |
| 3 - (триметилсилил) пропионовой кислотно-D 4 (TSP) | Sigma-Aldrich | 269913 |
Ссылки
- Cani, P. D., Delzenne, N. M. Gut microflora as a target for energy and metabolic. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Метаболическое профилирование печениколонизация безмикробных мышейспектроскопия ЯМР 1Hвысокоразрешающий метод вращения под магическим угломанализ метаболитов мочиподготовка биопсии печенивзаимодействие с микробиотой кишечникаанализ метаболических путейрегистрация ЯМР-спектровмониторинг прогрессирующей колонизации
