Summary
זיהום של עכברים עם adenovirus להביע autoantigen אדם גדול ציטוכרום P450 2D6 (hCYP2D6) המוכרים על ידי סרה של חולים הסובלים מסוג 2 תוצאות אוטואימוניות הפטיטיס בצורה מתמשכת של מחלה אוטואימונית בתיווך הכבד המאופיינת סיסטיק נרחב צהבת, ואת הדור של CYP2D6 ספציפית התגובה החיסונית.
Abstract
הפטיטיס אוטואימונית היא מחלה אוטואימונית נדירה אך סכנת חיים של הכבד של 1,2 שהגורם לה אינו ידוע. במהלך ניסיונות רבים בעבר נעשו כדי לייצר מודל בעל חיים המשקף את המאפיינים של המחלה האנושית 3-5. עם זאת, מודלים שונים אינדוקציה של המחלה היה מורכב למדי, לעתים קרובות הפטיטיס היה חולף רק 3-5. לכן, פיתחנו מודל עכבר פשוטה המשתמשת autoantigen אדם מרכזי מסוג 2 הפטיטיס אוטואימונית (AIH-2), כלומר hCYP2D6, כמו ההדק 6. 1 סוג כבד כליות נוגדנים microsomal (LKM-1) נוגדנים הכרה hCYP2D6 הם סימן ההיכר של AIH-2 7,8. מסירת hCYP2D6 אל wildtype FVB או C57BL / 6 עכברים היתה לבנות adenovirus (Ad-2D6), אשר מבטיחה אספקה ישירה של האנטיגן מפעילה אל הכבד. לכן, דלקת מקומית שלאחר מכן יוצר שדה פורה 9 לפיתוח הבאות של אוטואימוניות. גombination של הזרקה תוך ורידית ו intraperitoneal של Ad-2D6 היא הדרך היעילה ביותר כדי לגרום נזק לטווח ארוך אוטואימונית אל הכבד (סעיף 1). כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט על איך אוטואימונית מחלות כבד מושרה במודל CYP2D6 וכיצד היבטים שונים של נזק לכבד ניתן להעריך. ראשית, רמות בסרום של סמנים המעידים על הרס hepatocyte, כגון aminotransferases, כמו גם את titers של hCYP2D6 נוגדנים נקבעים באמצעות דגימת דם retroorbitaly (סעיף 2). שנית, התגובה hCYP2D6 ספציפי תא T מאופיינת באיסוף לימפוציטים של הטחול והכבד. על מנת לקבל לימפוציטים כבד טהור, הכבדים הם perfused ידי PBS דרך וריד השער (סעיף 3), מתעכל על קולגן מטוהרים על שיפוע Percoll (סעיף 4). התדירות של hCYP2D6 ספציפיים בתאי T מנותח על ידי גירוי עם hCYP2D6 פפטידים וזיהוי של תאים מייצרי IFNγ ידי cytometry זרימה (סעיף 5). שלישית,חדירת הסלולר סיסטיק והוא נקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה של סעיפים כבד (סעיף 6). משטר ניתוח כזה חייב להתנהל על פי כמה לאחר תחילת המחלה, כדי להוכיח את האופי הכרוני של המודל. עוצמת התגובה החיסונית מתאפיינת בתדירות הפעילות של hCYP2D6-T הספציפיים ו / או תאים מסוג B ואת מידת הנזק הכבד סיסטיק צריך להעריך להערכה בדיעבד של הטיפולים האפשריים כדי למנוע, לעכב או לבטל את autodestructive תהליך של הכבד.
Protocol
1. מתן תוך ורידי של 2D6-Ad לתוך הסינוס עיניים
- בתנאים סטריליים, לדלל את Ad-2D6 המניות וירוס הפתרון בריכוז של 5 X 10 9 pfu / מ"ל ב RPMI ולשמור פתרון Ad-2D6 וירוס על קרח. הזרקה של שני מינונים של 5 X 10 8 pfu (תוך ורידי ו intraperitoneal) הוכיחה לגרום התוצאה המהימנה ביותר של דלקת כבד אוטואימונית בעכברים של מתח FVB.
- להרדים עכבר עם 4% isoflurane בתא הרדמה. לצבוט את רגלו האחורית כדי לוודא שבעל החיים הוא מורדם.
- החזק את העכבר על החלק האחורי של הצוואר להדק את העור הרפוי של הראש עם האגודל והאמה. כך, העין הבולטת מעט על ידי המתיחה על העור הסמוך לעין.
- מכניסים את המחט בצורה אנכית לתוך canthus המדיאלי (צומת של העפעפיים הקרוב לאף של החיה) ולאט לאט להזריק 100 הפתרון μl Ad-2D6 וירוס. חשוב לא להפעיל לחץ רב מדי, כדילמנוע פגיעה של כלי שיט קנה הנשימה.
- לאט לאט למשוך את המחט, כדי למנוע דליפה ולסגור את העפעפיים.
- הזרקת עבד גם אם הפתרון וירוס לא לדלוף שוקת האף והעין גולשת בחזרה למצב ההתחלתי שלה.
- מיד לאחר ההזרקה לווריד, לבצע הזרקת intraperitoneal רמת 100 μl 2 של פתרון Ad-2D6 את הנגיף.
לחלופין, הזרקה ניתן לבצע דרך וריד הזנב. עם זאת, באמצעות הזרקת סינוס עיניים הרבה יותר קל לביצוע, מצמצם את ההפסד של פתרון וירוס. הוכח כי שתי הטכניקות הללו ניתן להשתמש לסירוגין, וכי שני מסלולים יעילים באותה מידה 10.
עכברים נגועים מנוטרים על תופעות לוואי או סימנים ברורים של סבל וכאב, כגון אובדן תיאבון, אובדן משקל, אובדן ניידות, אי החתן, פרווה גסה, כפוףההופעה, כמו גם ללקק, לנשוך, שריטה, או לוחץ על אזור מסוים (למשל באתר של ההזרקה). למרות העכברים להציג נזק גדול לכבד במודל CYP2D6, העכברים נראה בריא ולהראות סימנים של כאב או סבל, או לחץ. עם זאת, האינדיקטורים של אי ספיקת כבד חמורה, כגון aminotransferases בסרום נקבעים על בסיס קבוע או חלק הניסויים שבוצעו. רמות בסרום של aminotransferase> 1000 U / l צריך להופיע רק כתוצאה ישירה של זיהום בנגיף, אך לא באופן כרוני. אם רמות aminotransferase בסרום הם כרוניים מעל 1000 U / L (מגבלת חומרה) העכברים מוקרבים.
2. עין עכבר דימום
- להרדים עכבר עם 4% isoflurane בתא הרדמה. לצבוט את רגלו האחורית כדי לוודא שבעל החיים הוא מורדם.
- החזק את העכבר על החלק האחורי של הצוואר להדק את העור הרפוי של הראש עם האגודל והאמה. כך, העין הבולטת מעט על ידיהמתיחה על העור הסמוך לעין.
- הניחו את קצה צינור נימי בפינה התחתונה או הפנימי של העין בעדינות אך בתקיפות החליק לצד גלגל העין כדי סינוס ורידי עיניים. הקרע נימים ורידים ו דימום כתוצאה ממלא את חלל מסלולית.
- קצת למשוך את צינור נימי לשחרר עצה כך את הדם המצטבר הוא נשאב לתוך הצינור.
- כאשר כמות מספקת של דם נאסף, הצינור הוא מכונס העפעפיים סגורים. הדימום נפסק עם הנסיגה של הצינור ואת הקמתה מחדש של לחץ עינית רגילה על מורכבות ורידים.
- דם בצינור נימי מועבר צינור Microtainer ו מודגרות למשך 30 דקות על הקרח.
- צינור Microtainer הוא centrifuged ב XG 7500 דקות 2 ב 4 ° C.
- Supernatant מתאים בסרום אשר מועבר צינור טרי המאוחסן ב -80 ° C.
- סרום יכול לשמש כדי לקבוע כייל נוגדנים על ידי ELISA. Indicaממשיכי נזק לכבד כגון רמות בדם של אנזימי הכבד aminotransferase אלאנין (ALT / GPT) ו aspartate aminotransferase (AST / יש) ניתן להעריך באמצעות מקלוני הבדיקה על פי מ Roche Diagnostics (מנהיים, גרמניה) Reflotron פלוס Analyzer ( Roche Diagnostics, מנהיים, גרמניה).
לחלופין, הדגימה דם ניתן לעשות זאת דרך וריד הזנב או דרך הווריד הטמפורלי השטחי 11.
3. הכבד עכבר זלוף
הערה: שלב זה חשוב כדי למנוע זיהום כבד של לימפוציטים בודדים על ידי לימפוציטים בדם
- להרדים את העכבר על ידי מינונים קטלניים של CO 2 ואחריו פריקה צוואר הרחם.
- הר חיה להניח על גבו על לוח קלקר. השתמש 23 מחטים G כדי להצמיד הגפיים.
- לחות ולחטא את העכבר עם EtOH 70%
- כ 1 ס"מ במרחק של הרגליים האחוריות, לבצע חתך דרךאת העור ואת שכבת השריר. חותכים משני צידי החיה עבודה עד הסרעפת.
- כאשר הסרעפת הוא הגיע העור ניתן התהפך אחורה.
- חותכים את הסרעפת הרחק קורע את ולאחר מכן לחתוך את הווריד הנבוב.
- העבר את הקיבה ואת המעיים בצד, חושפת את הווריד הפורטל.
- ברוח פורטל להוסיף מחט 27 G מחובר מזרק 5 מ"ל מלא קר PBS. בואו PBS לאט לשטוף את הדם אל מחוץ לכבד.
- לנתח את הכבד על ידי גרירה אל הסרעפת חיתוך הסרעפת מהגוף.
- להעביר את הכבד לצלחת פטרי ולהסיר את הסרעפת, כיס המרה וכל רקמה אחרת עדיין מחובר אל הכבד
- להעביר את הכבד עד 10 מ"ל PBS בצינור 50 מ"ל על קרח או להטביע במתחם אוקטובר
4. הבידוד של לימפוציטים כבד
- הכן את הפתרונות המניות הבאות:
- Collagenase IV המניות (100 מ"ג / מ"ל) אניn PBS. (תן aliquots קטנים בחנות ב -20 ° C).
- DNase המניות (25 מ"ג / מ"ל) ב PBS. (תן aliquots קטנים בחנות ב -20 ° C).
- Collagenase חיץ: PBS המכיל 0.2 מ"ג / מ"ל collagenase הרביעי, 0.02 מ"ג / מ"ל ו DNase FCS 5%, על הכבד 1, מערבבים 9.5 קר כקרח מ"ל PBS, 20 μl collagenase IV (100 מ"ג / מ"ל המלאי), 8 DNase μl ( 25 מ"ג / מ"ל מניות), ו - 500 μl חום מומת FCS.
- Percoll 35%, תערובת 175 מ"ל Percoll, 20 מ"ל 10 x PBS המניה, 305 מ"ל PBS.
- RPMI מלאה = RPMI המכיל 10% חום מומת FCS, μ 100 / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין.
- להעביר את הכבד perfused (ראה סעיף 3) על 10 מ"ל של PBS טרי בצלחת פטרי על קרח וחותכים לחתיכות קטנות באמצעות מספריים.
- מעבירים לתוך מסננת 70 מיקרומטר תאים בכבד ג'ונקות להידחק דרך עם העלי זכוכית או העלי מ מזרק 2 מ"ל. בזהירות להוסיף 10 מ"ל חיץ collagenase קרלחץ דרך מסננת. איסוף ההשעיה ולסנן דרך מסננת פעמיים נוספות.
- להעביר את ההשעיה על צינור 50 מ"ל טריים על קרח. לעבד הכבד הבא.
- דגירה תא השעיה כבד על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, לערבב בעדינות כל 15 דקות.
- סרכזת XG ב 30 דקות 3 על 4 ° C.
- העברת supernatant לצינור טרי, עוזב 5 מ"מ נוזל מעל גלולה
- סרכזת ב XG 650 דקות 10 ב 4 ° C.
- מחק supernatant, והשאיר 3 מ"מ מעל גלולה
- Resuspend גלולה ב 20 מ"ל Percoll חיץ
- סרכזת ב XG 600 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
- מחק supernatant ו resuspend גלולה ידי מצליף צינור.
- לשטוף גלולה 1 X עם PBS.
- לשטוף גלולה 1 X עם RPMI המלא
- Resuspend גלולה ב 3 מ"ל RPMI להשלים לספור תאים בדילול 1:10.
- תאים Resuspend ב ~~~HEAD=NNS 10 7 תאים / מ"ל RPMI להשלים ולהעביר צינור לקרח. 5. ציטוקינים מכתים תאיים (ICCS)
- הכן לימפוציטים הכבד בבית ~~~HEAD=NNS 10 7 תאים / מ"ל RPMI מלאה כמתואר. 100 μl פלייט (10 6 תאים) / גם לתוך צלחת שטוחה 96-היטב שאינו רקמות התרבות טיפול.
- הוסף 50μl RPMI להשלים המכיל 2μg/ml Brefeldin ולאחר מכן להוסיף 50μl RPMI שלם המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל גירוי CYP2D6 פפטיד (כלומר את CD4 immunodominant epitope CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 או immunodominant CD8 epitope CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). מערבבים ידי pipetting.
- דגירה של 5 שעות ב 37 ° C (זמן הדגירה גירוי אופטימלי אבל עובד גם בלילה).
- הכן את הפתרונות המניות הבאות:
- FACS חיץ: PBS המכיל 1% של עוברי עגליםerum (FCS).
- קיבוע / Permeabilization חיץ: FACS מאגר המכיל 0.1% ו saponin paraformaldehyde 4%
- FACS / saponin חיץ כביסה: FACS מאגר המכיל saponin 0.1%
- FACS / PFA חיץ: FACS מאגר המכיל paraformaldehyde 1% (PFA)
- להעביר את התאים לתוך צלחת V-התחתונה microtiter (96 גם) ומסובב ב XG 460 דקות 3 ב 4 ° C. בטל בינוני הצלחת מערבולת
- הוסף 150 μl חיץ FACS ו צנטריפוגות ב XG 460 דקות 3 על 4 ° C. בטל בינוני הצלחת מערבולת. חזור על לשטוף את הצעד.
- השטח חסום FCR במידת הצורך (בעת שימוש משני נוגדנים) עם קוקטייל 1 αCD16/32 מיקרוגרם / מ"ל (בלוק FCR) במאגר FACS במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף 2 x 150 עם חיץ מכתים μl (460 XG דקות 2 ב 4 ° C).
- כתם של מולקולות על פני השטח: כלומר נגד CD8a-FITC MAB 10 מיקרוגרם / מ"ל במאגר FACS 50 μl למשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
- הוסף 100 μl FACSחיץ ספין על XG 460 דקות 3 ב 4 ° C.
- לשטוף תאים עם 2 x 150 חיץ FACS μl (460 XG, 3 דקות, 4 ° C). מערבולת צלחת.
- תקן / permeabilize תאים עם מאגר 100 קיבוע / permeabilization μl 10 דקות ב RT.
- מסובבים XG 460 דקות 7 ב 4 ° C. שים לב, חשוב להאריך את המועד צנטריפוגה ל 7 דק ', שכן קיבוע / צעדים permeabilzation משנה את הצפיפות הכוללת של התאים. מערבולת צלחת.
- לשטוף 2 x 150 עם FACS / μl בופר שטיפה saponin (460 XG, 7 דק ', 4 ° C). מערבולת צלחת.
- כתם על מולקולות תאיים: כלומר נגד IFNγ-PE MAB 10 מיקרוגרם / מ"ל ב -50 FACS / μl בופר שטיפה saponin למשך 30 דקות ב 4 ° C.
- הוסף 100 μl FACS / חיץ לשטוף saponin ומסובב ב XG 460 דקות 7 ב 4 ° C.
- לשטוף את התאים 2 x 150 עם FACS / μl בופר שטיפה saponin (460 XG, 7 דק ', 4 ° C). מערבולת צלחת.
- לשטוף את התאים 1 X עם FACS חיץ (460 XG, 7 דק ', 4 ° C). מערבולת צלחת. תאים Resuspend ב -200 μl FACS / PFA חיץ, העברת לתוך צינורות, וחנות ב 4 ° C בחושך עד רכישת נתונים על ידי cytometry הזרימה. בדרך כלל אנחנו משתמשים ב 'FACSCanto או FACSCalibur (BD Biosciences, היידלברג, גרמניה).
- הכבד קציר, לטבול רקמות Tek אוקטובר בתבנית בסיס חד פעמי הקפאה מהירה על קרח יבש.
- חותכים 7 חלקים רקמות הכבד מיקרומטר באמצעות cryostat Leica נקבע -17 ° C ו הר בסעיפים רקמות על Superfrost פלוס שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות חנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
- תקן cryosections שלפני מקורר EtOH במשך 15 דקות ב -20 ° C. בוא יבש 10 דקות.
- לשטוף 2 x במים מזוקקים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (את השלבים הבאים, 6.1.5 - 6.1.13, מבוצעות בטמפרטורת החדר).
- הכתם בתמיסה של מאיר Hematoxylin עבור8 דקות.
- להתרחץ חמים (30 מעלות צלזיוס) מי ברז במשך 10 דקות. הזמנים משתנים מים שונים.
- יש לשטוף במים מזוקקים.
- יש לשטוף ב EtOH 95% עבור 20 שניות.
- Counterstain בפתרון G / Y Eosin עבור 40 שניות.
- מייבשים 2 x ב EtOH 95% עבור 5 דקות לכל הדגירה.
- מייבשים 2 x ב EtOH 100% עבור 5 דקות לכל הדגירה.
- ברור 2 x קסילן 5 דקות לכל סליקה.
- הר ב-Histokitt רוטי.
- הכבד קציר, לטבול רקמות Tek אוקטובר בתבנית בסיס חד פעמי הקפאה מהירה על קרח יבש.
- חותכים 7 חלקים רקמות הכבד מיקרומטר באמצעות cryostat Leica נקבע -17 ° C ו הר בסעיפים רקמות על Superfrost פלוס שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות חנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
- תקן cryosections ב EtOH קרים למשך 15 דקות ב -20 ° C. בוא יבש 10 דקות.
- לשטוף 2 x ב PBS 2 דקות בטמפרטורת החדר. <li> דגירה של PBS המכיל 0.3% H 2 O 2 ו -0.1% Na-אזיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 2 x ב PBS 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- חסום עם ערכת avidin-ביוטין חסימת פי הנחיות היצרן.
- חסום עם FCS 10% PBS (FCS / PBS) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הנוגדן העיקרי הוא אנטי העכבר ארנב קולגן נוגדנים אני אשר מדולל 1:200 ב 10% FCS / PBS. דגירה חלקים עם הנוגדן העיקרי 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את סעיפים 3 x ב PBS 4 דקות בטמפרטורת החדר.
- לדלל biotinylated נוגדנים נגד ארנב 1:500 ו דגירה עם קטעים של 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את סעיפים 3 x ב PBS 4 דקות בטמפרטורת החדר.
- תגובת צבע מתקבל על ידי הדגירה רציף עם הצמוד avidin-peroxidase ו-diaminobenzidine מי חמצן על פי הנחיות היצרן.
- ב Counterstain של מאיר הואפתרון matoxylin 5 דקות, לשטוף 2 x ב PBS 2 דקות בטמפרטורת החדר לעלות ב Aquatex.
5.1 גירוי:
5.2. צביעה:
6. אימונוהיסטוכימיה
6.1. H & E מכתים להערכת פתולוגיה כללית הכבד:
6.2. אימונוהיסטוכימיה בתצהיר קולגן אני:
7. נציג תוצאות
זיהום של עכברים עם Ad-2D6 המושרה בשני שלבים שונים של נזק לכבד. בימים הראשונים לאחר ההדבקה, הווירוס דלקת של הכבד גורמת לעלייה חדה של רמות aminotransferase בסרום, המשקפת את מותו hepatocyte 6. זה השלב הראשון, חריפה מתרחשת עצמאית הביטוי של hCYP2D6 והוא יכול להיות גם ציין לאחר ההדבקה בווירוס פקד ריק (Ad-Control) או וירוס לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (Ad-GFP). לעומת זאת, השלב השני הוא אוטואימונית בתיווך ותלויה ביטוי של מולקולה מפעילה hCYP2D6. שלב זה אוטואימונית מתרחשת בתוך 2-4 שבועות לאחר זיהום נמשכת כמה חודשים 6.
את התכונות הבאות אופייניות של הפטיטיס אוטואימונית מתמיד בפיתוח אחרי המודעות לזיהום-2D6 של wildtype FVB או C57BL / 6 עכברים במודל CYP2D6: ראשית, הכבד מראה מורפולוגיה שונה aberrantly. בפרט, את אונה של הכבד הם התמזגו, גושים hyperplasic מופיעים פזורים על פני הכבד כולו סיסטיק capsular מסיבית גלוי (איור 2).
איור 2. מורפולוגיה הכבד. נזק אופייני Ad-2D6-Induced הכבד זוהה ליום 4 זיהום שלאחר השבוע. שים לב, את אונה של הכבד בודדים התמזגו (ראשי חץ). גושים Hyperplasic מופיעים פזורים על פני הכבד כולו (חיצים). זיהום adenovirus השליטה לא להביע hCYP2D6 אין כל השפעה על מורפולוגיה הכבד.
חדירות הסלולר השנייה, מקיף ומתמשך מופיעים באזורים פרי-פורטל parenchymal של הכבדים של העכברים Ad-2D6-נגועים אך לא Ad-Control-הנגוע (איור 3 א). סיסטיק מפתחת בעיקר באזור subcapsular עם כמה חבילות קולגן בולטות לתוך parenchyma (איור 3 ב).
איור 3. היסטולוגיה הכבד. H & E מכתים סעיף הכבד רקמות של עכברים נגועים FVB Control-Ad או Ad-2D6 ב 4 זיהום שלאחר שבוע. שים לב, חדירות משמעותיות של תאים mononuclear נמצאים רק מודעות למוצרי 2D6 עכברים נגועים (חיצים בודדים). החצים מצביעים על טריפל חדירות סלולריים גדולים יותר parenchyma הכבד גישור בין שטחים פורטל השכנות. ב ': ייצוג immunohistochemical של לייפת הכבד בשבוע 4 לאחר ההדבקה עם 2D6, מודעות או מודעות שליטה. הסעיפים כבד כבר מוכתם עבור קולגן באמצעות נוגדנים נגד קולגן אני. הערה שכבה כפולה של אופי קולגן מתחת הקפסולה הכבד (חצים משולשים) עם כמה חבילות בולטות לתוך parenchyma (חיצים בודדים) ואת הנוכחות של קבוצות גדולות של תאים שחדרו (ראשי חץ). שני קטעים מייצגים כבד מוצגים עבור כל תנאי. גודל ברים: 100μm.
התכונה השלישית היא דור titers גבוהות של נוגדנים נגד CYP2D6, אשר יש סגוליות epitope דומה LKM-1 נוגדנים אנושיים 6,13. האחרונות, hCYP2D6 ספציפיים CD4 ו CD8 ותאי ה-T נוצרות בעיקר כי ביתם של הכבד. כאלה hCYP2D6 ספציפיים בתאי T ניתן לאתר על ידי גירוי עם immunodominant hCYP2D6 פפטידים מדידה בדיעבד של הביטוי IFNγ ידי מכתים ציטוקינים תאיים (ICCS) (איור 4). hCYP2D6 ספציפיים CD8 ותאי T הורגים Ad-2D6-נגועים בתאי היעד in vivo 12.
באיור 4. hCYP2D6 ספציפית בתאי ה-T. ניתוח תזרים cytometric של hCYP2D6 ספציפית בתאי T. לימפוציטים הכבד היו מבודדים בשבוע 4 אחרי המודעות לזיהום-2D6 והיו מגורה עם או את CD4 או CD8 immunodominant hCYP2D6 epitope לילה. דור של IFNγ זוהה על ידי צביעה ציטוקינים תאיים ונותחו על ידי cytometry הזרימה באמצעות FACS קנטו II (BD Biosciences, היידלברג, גרמניה). אחוז hCYP2D6 ספציפיים CD4 ו CD8 ותאי מצוין.
Discussion
במחקרים קודמים, הפטיטיס ניסיוני דווח לעתים קרובות להיות רק המודלים הנוכחיים רגעיות רבים עבור מחלת כבד אוטואימונית תלוי אינדוקציה כמה פרוטוקולים מורכבים ולא המחלה (עבור ביקורות לראות 3,5). לדוגמה, מספר דגמים להשתמש העכברים הטרנסגניים ביטוי אנטיגנים יעד ספציפיים ולהעביר adoptively היעד אנטיגן ספציפי, בעיקר TCR-מהונדס, ותאי T 14,15. לעתים קרובות זיהום נוסף עם וירוסים, חיידקים או טפילים livertropic יש צורך לגרום למחלות 16-18. לחילופין, ה-DNA חיסון עם פלסמידים קידוד אנטיגנים היעד, כולל CYP2D6 19, משמש כדי לגרום דלקת הכבד. עם זאת, חיסון נוסף עם פלסמידים קידוד Pro ציטוקינים דלקתיים, כגון IL-12, נדרש 20. למרבה הצער, עם כמה יוצאים מן הכלל 15,20 הפטיטיס הוא זמני בלבד.
המודל CYP2D6 6,21 משתמש לא שיטה פשוטההו לגרום דלקת כבד אוטואימונית פשוט על ידי הדבקה של עכברים עם adenovirus להביע hCYP2D6, autoantigen מרכזי AIH-2 7,8. משלוח של CYP2D6 על ידי מבנה adenovirus מבטיח גם מיקוד ישיר של הכבד, כמו גם דלקת מקומית המקדמת פירוט של סובלנות. חשוב לציין עם זאת כי הן כייל הנגיף, כמו גם את המסלול של הממשל היא קריטית דגם זה. מצד אחד, Ad-2D6 הוא וירוס שכפול לקויה, ובכך, כייל גבוה מספיק של וירוס נדרש לייצר כמות קריטית של האנטיגן בתוך הכבד. מצד שני, גבוה מדי כייל עלולה לגרום לאי ספיקת כבד חריפה קטלנית. בנוסף, הוכח בעבר כי זיהום של עכברים על ידי titers גבוהות של adenovirus מוביל תשישות תפקודית של התגובה החיסונית 22. במודל זה, השתמשנו בשילוב של זיהום תוך ורידי ו intraperitoneal על מנת לקבל גם חדירת הסלולר כרונית, כמו גם שלוחהensive פיברוזיס. ראינו כי זיהום תוך ורידי בלבד עדיין גורם חדירת הסלולר מסיבי, אבל לא סיסטיק האזור subcapsular, המציין כי דלקת הצפק עקב הזרקת intraperitoneal יכול להיות מעורב הצטברות subcapsular רציפה של קולגן (Hintermann & להטביל, כתב היד בהכנה). עם זאת, חשוב לציין כי סיסטיק הכבד הנצפה הוא אנטיגן ספציפי, שכן לא גילינו הפעלת stellate תאים בכבד וכן בתצהיר קולגן לאחר ההדבקה עם שוויון titers וירוס של ה-GFP, מודעות או מודעות-Control 23.
המודל CYP2D6 משקף היבטים רבים של 1,2 AIH האדם, כגון דלקת כבד כרונית המאופיינת על ידי חדירת הסלולר מתמשך לייפת הכבד 6. בנוסף, נוכחות גבוהה כייל נוגדנים נגד CYP2D6 עם ייחוד epitope דומה והפצת 13 ל LKM-1 נוגדנים הנמצאים AIH-2 בחולים מציין מראשהיגיון של התגובה הנפוצה אוטואימונית כרונית. CYP2D6 הוא אנטיגן מרכזי AIH-2, אבל זה לא מוכר על ידי חולים שאובחנו עם AIH תכופים יותר מסוג 1. בנוסף, חולים הסובלים ממחלות כבד אחרות עם אטיולוגיה אוטואימונית, כגון שחמת המרה הראשי (ות"ת) או העיקרי sclerosing cholangitis (PSC), לייצר נוגדנים עצמיים סימן ההיכר עם סגוליות כדי autoantigens כבד שונות ואת הכבדים שלהם להראות תכונות פתולוגיים שונים שבמרכזו קטן (ות"ת ) או גדולים (PSC) צינורות המרה. עם זאת, CYP2D6 מודלים מציעה את ההזדמנות לנתח את מנגנוני immunopathogenic המעורבים בתהליכים דלקתיים כרוניים בכבד כמו המתרחשים במהלך מחלות כבד אוטואימוניות, לזהות את שחקני המפתח המניעים את ההרס אוטואימונית של hepatocytes ולהעריך התערבויות טיפוליות ניתן לרפא את המחלה.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת גתה בפרנקפורט החולים מענק של קרן המחקר הגרמנית UC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
| 27½G needle | VWR international | 612-0151 | |
| 30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
| Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Group | 10 745 138 202 | |
| Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Group | 10 745 120 202 | |
| Anaesthesia Unit Univentor 400 |  AgnTho’s |
||
| Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR international | 720-0208 | |
| Cell strainer 70mm | VWR international | 734-0003 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1850 UV | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher Scientific | 3123987 | |
| Microscope slides Superfrost Plus | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
| Microtiter plates, V-bottom | VWR international | 391-1924 | |
| Reflotron Plus | Roche Group | Determiniation of serum AST / ALT | |
| Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon International | AB765P | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | VC-BA-1000-MC15 | |
| FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | SouthernBiotech | 1550-02 | |
| PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Aquatex | VWR international | 1.08562.0050 | |
| Avidin/Biotin Blocking kit | Vector Laboratories | VC-SP-2001-KI01 | |
| Brefeldin A | Sigma-Aldrich | B6542 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138-100MG | |
| DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector Laboratories | VC-SK-4100-KI01 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Elite ABC Reagent | Vector Laboratories | VC-PK-7100-L050 | |
| Eosin G/Y solution | Carl Roth Gmbh | X883.1 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
| Isofluran | Forene | B506 | |
| Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
| OCT Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| PBS-buffered formaldehyde 10% | Carl Roth Gmbh | A146.3 | |
| Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
| Roti-Histokit | Carl Roth Gmbh | 6638.1 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 |
References
- Manns, M. P. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).
- Czaja, A. J., Manns, M. P. Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis. Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).
- Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. New animal models for autoimmune hepatitis. Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).
- Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. Animal models for autoimmune hepatitis. Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).
- Czaja, A. J.
- Holdener, M. Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection. J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).
- Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase. J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).
- Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).
- von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile. Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Forbes, N. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).
- Ehser, J. Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis. , Forthcoming (2011).
- Hintermann, E. Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model. J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).
- Ando, K. Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).
- Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).
- Limmer, A. Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment. Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).
- Voehringer, D. Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis. J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).
- Derkow, K. Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis. Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).
- Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens. Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).
- Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis. J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).
- Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty. J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).
- Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus. J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).
- Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis. Manuscript Submitted. , (2011).
