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La célula eucariota se basa en la compleja, altamente regulado, y los compartimentos de membrana ligados funcionalmente distintas que conservan una polaridad necesaria bioquímico para la correcta función celular. La comprensión de cómo las enzimas, proteínas, y componentes del citoesqueleto gobernar y mantener esta segregación bioquímica tanto, es de suma importancia. El uso de moléculas marcadas con fluorescencia para localizar y / o perturbar los compartimentos subcelulares se ha producido una gran cantidad de conocimientos y avanzar en nuestra comprensión de la regulación celular. Las técnicas de imagen tales como microscopía de fluorescencia confocal y hacer la determinación de la posición de una molécula de marcado fluorescentemente pequeña relativamente sencillo, sin embargo, la resolución de estructuras muy pequeñas se limita 1.
Por otra parte, la microscopía electrónica ha revelado los detalles de la morfología subcelular a una resolución muy alta, pero su naturaleza estática hace que sea difícil de medir pro altamente dinámicoprocesos con precisión 2,3. Así, la combinación de la microscopía de luz con el microscopio electrónico de la misma muestra, Light denomina correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) 4,5, proporciona la doble ventaja de formación de imágenes ultrarrápida fluorescente con la alta resolución de la microscopía electrónica 6. Esta poderosa técnica se ha aplicado para estudiar muchos aspectos de la biología celular 5,7. Desde su creación, este procedimiento ha aumentado nuestra capacidad de distinguir las arquitecturas subcelulares y morfologías de alta resolución.
A continuación, presentamos un método simplificado para realizar la microinyección rápida seguida de CLEM (Fig. 1). El procedimiento de CLEM microinyección puede ser utilizado para introducir cantidades específicas de moléculas pequeñas y / o proteínas directamente en el citoplasma de células eucariotas y estudiar los efectos de un milímetro a la resolución de varios nanómetros (Fig. 2). La técnica se basa en la microinyecciónlas células cultivadas en cubreobjetos de vidrio grabado láser reticulados fijados a la parte inferior de platos y de formación de imágenes de células vivas con tanto microscopía confocal fluorescente y electrones. La localización de la célula (s) de interés se ve facilitada por el patrón de rejilla, que se transfiere fácilmente, junto con las células de interés, a la resina Epon utilizado para la inmovilización de muestras y corte antes del análisis de microscopía electrónica (Fig. 3). Superposición de fluorescencia y las imágenes EM permite al usuario determinar la localización subcelular, así como los cambios morfológicos y / o ultraestructurales inducidas por la molécula microinyectado de interés (Fig. 4). Esta técnica es susceptible de puntos de tiempo que van desde ≤ 5 s hasta varias horas, dependiendo de la naturaleza de la muestra microinyectado.