Мы разработали 3D-моделей coculture для живых клеток изображений в режиме реального времени взаимодействия между опухолевых клетках молочной железы и других клеток в их микросреды, влияющих на прогрессирование инвазивного фенотипа. Эти модели могут служить в качестве экранов для доклинических наркотиков целевой паракринной вызванных протеолитических, хемокинов / цитокинов и киназы пути причастных к инвазии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
MAME Модели 4D Онлайн-клеточного изображения опухоли: микроокружение взаимодействия, что воздействие злокачественной прогрессии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы разработали модели 3D-сокультивирования, которые мы назвали MAME (mammary architecture and microenvironment engineering — инженерия архитектуры и микроокружения молочной железы), и использовали их для визуализации взаимодействий между клетками в режиме реального времени. Нашей общей целью было создание моделей, воспроизводящих архитектуру преинвазивных поражений молочной железы, для изучения их прогрессирования в инвазивный фенотип. В частности, мы разработали модели для анализа взаимодействий между вариантами предраковых эпителиальных клеток молочной железы и другими типами клеток опухолевого микроокружения, которые, как полагают, способствуют или препятствуют переходу преинвазивных эпителиальных клеток молочной железы в инвазивную протоковую карциному. Среди других типов клеток, изученных к настоящему времени, — миоэпителиальные клетки, фибробласты, макрофаги, а также эндотелиальные клетки кровеносных и лимфатических микрососудов. В дополнение к моделям MAME, предназначенным для воспроизведения клеточных взаимодействий в молочной железе при прогрессировании рака, мы разработали аналогичные модели для изучения прогрессирования рака предстательной железы.
В данном видео мы демонстрируем процедуры создания 3D-сокультивируемых систем, а также использование визуализации живых клеток и функционального анализа протеолиза для отслеживания перехода сокультур клеток протоковой карциномы молочной железы in situ (DCIS) и фибробластов к инвазивному фенотипу с течением времени, в данном случае — на протяжении двадцати трех дней культивирования. Сокультуры MAME состоят из нескольких слоев. Фибробласты иммобилизованы в нижнем слое коллагена I типа. Сверху наносится слой реконструированного базального мембранного матрикса (rBM), на который высевают клетки DCIS. Заключительный верхний слой 2% rBM добавляется и обновляется при каждой смене среды. Для визуализации протеолиза, связанного с прогрессированием к инвазивному фенотипу, мы используем флуоресцентные матриксные белки с гашенным свечением (DQ) (DQ-коллаген I смешивают с слоем коллагена I, а DQ-коллаген IV — со средним слоем rBM) и наблюдаем за живыми культурами с помощью конфокальной микроскопии. Оптические срезы захватываются, обрабатываются и реконструируются в 3D с помощью программного обеспечения для визуализации Volocity. В течение 23 дней в сокультурах MAME клетки DCIS пролиферируют и сливаются в крупные инвазивные структуры. Фибробласты мигрируют и включаются в эти инвазивные структуры. Флуоресцентные протеолитические фрагменты коллагенов обнаруживаются на поверхности структур DCIS, внутри клеток, а также распределены по всему окружающему матриксу. Препараты, воздействующие на протеолитические, хемокиновые/цитокиновые и киназные пути, или изменения в клеточном составе сокультур могут снижать инвазивность, что свидетельствует о возможности использования моделей MAME в качестве доклинического скрининга новых терапевтических подходов.
Протокол
1. Подготовить DQ-подложки
- Позвольте лиофилизированный DQ-подложки нагревали до комнатной температуры перед открытием флаконов, готовят маточный раствор 1 мг / мл DQ-подложки в деионизованной воды, разделить на 50 мкл аликвоты и хранят при температуре 4 ° C.
Это может быть необходимо, чтобы агитировать DQ-подложки в ультразвуковой ванне воды ~ 5 мин и тепла до 50 ° C для облегчения дисперсии.
- Оттепель УКР на льду в течение ночи при 4 ° С; УКР должны решаться на льду во все времена.
- Для того, чтобы 10 раз фосфатным буферным раствором (PBS), растворите 80 г NaCl (1,37 м), 2 г хлорид....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Как показано, MAME cocultures может быть использован для живых клеток изображений в режиме реального времени взаимодействия между различными сотовой избирателей, что составляет опухоли молочной железы и его микросреды. В текущие исследования в нашей лаборатории, мы использовали MAME cocultures определить протеолитические пути связано с переходом от DCIS к инвазивным раком протоков, а также взаимодействия между протеолитическими путей и других путей, участвующих в этом переходе, таких как хемокинов / цитокинов / рост пут.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана, в частности, от Национального института здоровья R01 CA131990 (BFS и RRM). Онлайн-клеток изображений проводили в основной микроскопии и обработки изображений цитометрии ресурсов поддерживается, в частности, по гранту Центра NIH P30 CA22453 к Karmanos института рака, Wayne State University и отделения перинатологии исследований Национального института детского здоровья и развития , Wayne State University.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент / Оборудование | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Восстановленный базальной мембраны (Cultrex) | Trevigen | 3445-005-01 | Сопоставимые с Матригель (BD Biosciences) |
| Коллаген я | Сплоченность лаборатории | 5005-B | |
| DQ-подложки (Коллаген I, IV) | Invitrogen | DQ-кол I-D12060 DQ-кол IV D12052 | |
| 22-мм пластиковыми покровные | Компания Fisher Scientific | 12-547 | Разрежьте пополам, оставит в 70% этаноле в течение 10 мин и воздушно-сухой перед использованием. |
| Среду клеточной культуры | Lonza | MEBM CC-PRF-3153 MEGM CC-4136 | Фенол красный бесплатно |
| ibiTreat μ-Блюдо | Ibidi | 80136 | |
| Volocity программного обеспечения | Перкин-Элмер | Версия 5.5 | Другие бренды изображений программное обеспечение может быть использован для создания 3D-реконструкции и фильмов. |
Ссылки
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
