إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

Summary

و

Abstract

حي التصوير الخلية هو أسلوب مهم ينطبق على عدد من الأنسجة ذبابة الفاكهة المستخدمة كنماذج للتحقيق في مواضيع مثل مواصفات المحور، تمايز الخلايا وتوالد ^1. إعداد الصحيح للنماذج تجريبية هي الحاسمة، وغالبا ما تهمل، خطوة. الهدف من إعداد هو التأكد من ملاءمة الفسيولوجية وإلى إيجاد ظروف التصوير المثلى. للمحافظة على سلامة الأنسجة، وهذا أمر بالغ الأهمية لتجنب، نقص الأكسجة الجفاف، وتدهور أو ارتفاع درجة حرارة متوسطة ^2.

غرفة البيض ذبابة الفاكهة هو نظام راسخ لدراسة المسائل ذات الصلة، ولكن ليس على سبيل الحصر، إلى تنميط الجسم، وتوطين مرنا وتنظيم هيكل الخلية ^3،4. بالنسبة لغرف البيض في وقت مبكر، ومنتصف المسرح، وتصاعد في الهالوكربون النفط هو جيد للبقاء على قيد الحياة لأنه يتيح نشر خالية من الأكسجين، ويمنع الجفاف ونقص الأكسجة ولها خصائص بصرية رائعة للفحص المجهري. ايمالشيخوخة من البروتينات الفلورية هو ممكن من خلال إدخال الجينات المحورة في غرفة البيض أو حقن المادية من الحمض النووي الريبي وصفت، والبروتين أو الأجسام المضادة ^5-7. على سبيل المثال، إضافة إلى البنى MS2 جينوم الحيوانات يتيح مراقبة الوقت الحقيقي من mRNAs في البويضة ^8. هذه التركيبات تسمح في وضع العلامات المجراة من مرنا من خلال الاستفادة من التفاعل MS2 الحمض النووي الريبي عاثية حلقة الجذعية مع بروتين معطف ^{9 منه.}

هنا، نقدم لبروتوكول لاستخراج المبيض وكذلك عزل ovarioles الفردية والغرف البويضة من ذبابة الفاكهة من الإناث. للحصول على وصف مفصل من الكرسي ذبابة الفاكهة oogenesis Spradling جيم ألان (1993، طبعة 2009) ^10.

Protocol

1. ذبابة الفاكهة التحضير المسبق للتشريح (وفقا لهاء Gavis، جامعة برينستون)

1. تجاهل الكبار من زجاجة المصنف قليلة ونقل زجاجة إلى 25 درجة مئوية في وقت مبكر من تجربتك. مرة واحدة البالغين جديدة قد بدأت في الظهور، والانتظار ليومين.
2. أخذ قارورة تحتوي على ذبابة 10ML تقريبا من المواد الغذائية الصلبة وإضافة 0،5-0،7 غرام من الخميرة الجافة (انظر الجدول) على زاوية 45 درجة. لا تغطي كامل سطح من المواد الغذائية الطاير مع الخميرة.
3. إضافة بضع قطرات من الماء على الخميرة، كافية لهيدرات (الشكل 1A). وضع قنينة على 45 درجة، والسماح حوالي 3 دقائق لخميرة لامتصاص الماء (الشكل 1B).

ملاحظة: بدلا من ذلك، بريميكس خميرة لصق في وعاء منفصل وإضافة إلى عجينة القارورة مع ملعقة.

4. تخدير الذباب في قارورة عن طريق حقن غاز ثاني أكسيد الكربون _2. عندما يتوقف عن الحركة، ترجيح كفة الذباب فاقد الوعي على وCO ₂
5. عزل 10-15 إناث و 5 ذكور من النمط الجيني المطلوب تحت نطاق تشريح مع فرشاة الدهان يميل غرامة (1D الشكل). الذكور واضحة عن وجود claspers، بنية داكنة جاحظ، في الخلفية الخاصة بهم.
6. إضافة إلى تحديد ذباب القنينة yeasted (الشكل 1E). مكان في درجة مئوية (25) ل24-60 ساعة. احتضان لفترات زمنية أقصر لأكبر في المئة من الشباب إلى منتصف خشبة المسرح وغرف بيضة فترات زمنية أطول في ساعة متأخرة من غرف بيضة المرحلة.

2. ذبابة الفاكهة تشريح المبيض

1. وضع قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون على رقم 1.5، 22 × 50 مم الغطاء زلة (الشكل 2A). تعيين زلة غطاء المعدة إلى الجانب حيث أنها لن تكون في الطريق.
2. تخدير الذباب في حقير yeasted عن طريق حقن غاز CO ₂ وطرف على وسادة ₂ CO.
3. استخدام حاد غرامة الانف ملقط لفهم الفرد مسمن الإناث في الأمامية من البطن (وليس بين اله البطن والصدر) (الشكل 2B-C).
4. عقد الأنثى مع ملقط وعرض تحت المجهر تشريح، تقريبا 2-3 سم فوق ساترة المعدة.
5. ما زالت تحتجز في الأمامية، واستخدام مجموعة ثانية من الملقط لإزالة الأنسجة في الخلفية المتطرفة للأنثى (الشكل 2D). ملاحظة: أنسجة الأمعاء ستنسحب من عادة مع نهاية الخلفي. مسح الأنسجة المأخوذة من الملقط.
6. في حين لا تزال تحمل الإناث في الأمامية، واستخدام الملقط مسح للضغط بلطف أو تدليك البطن، والعمل من أجل الأمامي الخلفي. تدليك البطن في نفس منوال ازالة معجون الاسنان من نهاية أنبوب.
7. وسيتم دفع هيكلين مبهمة واسعة من البطن والعصا في نهاية ملقط (الشكل 2E-F). هذه هي المبايض المقترنة.
8. تلمس المبيضين على النفط الهالوكربون على الشريحة أدناه.
9. كرر تشريح 1-2 مرات لإعطاء ما مجموعه 4-6 المبيضين في مجال النفط على ساترة (الارقام ..ه 2G).

3. عزل ovarioles

ملاحظة: كل مبيض يحتوي على حوالي 16 ovarioles تتكون من غرف بيضة 6 إلى 10 من المراحل المختلفة مرتبة مثل الخرز على الخيط ^10.

ملاحظة: قبل عزل ovarioles، وضبط مصدر الضوء على مجهر تشريح حتى يتسنى للإضاءة الضربات بزاوية حادة للعينة. وهذا يعطي خلافا للعينة، ويسمح التصور من الدوائر مرحلة الشباب البيض.

1. في مجال النفط، فصل 2 المبايض عن طريق إزالة الأنسجة التي تربط في نهاية الخلفي (مراحل العمر) مع ملقط مغلق (الشكل 3A).
2. توجيه المبيض الفردية مع أقدم مراحل لمرحلة اليسار وأصغر إلى اليمين. البويضة مرحلة الشباب الغرف في المبيض تكون شفافة وتشكل نهاية مدببة أكثر من المبيض.
3. مع زوج من الملقط في اليد المسيطرة، فهم بلطف الخلفي من المبيض، ويفضل من قبل فلول عشرالنسيج الضام ه. في حين الضغط على المبيض في مكان مع ملقط، واستخدام مسبار تشريح (أو إبرة التنجستن) لاستخلاص ovarioles الفردية (الشكل 3B-D).

ملاحظة: سيتم قطع ovarioles فردية بين مراحل الشباب (germarium لاستضافة 10) كما أقدم مراحل كبيرة جدا بحيث لا يمكن فصلها عن مبيض كامل.

ملاحظة: ثقب 1 البويضة مرحلة متأخرة مع لجنة التحقيق تشريح سيؤدي في السيتوبلازم تتسرب إلى جعل النفط واستخراج ovarioles الفردية صعبة للغاية. إذا تم ثقب البويضة مرحلة متأخرة، الانتقال إلى المبيض الطازجة.

4. مرة واحدة في ovariole خالية من المبيض، واستخدام لجنة التحقيق تشريح لجرها إلى وسط تراجع النفط والمشرق في الاتجاه المرغوب فيه للتجربة. ملاحظة: Ovarioles في النفط سوف تستقر والتمسك الزجاج.
5. كرر هذه العملية (3،3-3،4) حتى أن هناك 15-25 ovarioles الفردية. ملاحظة: هذا قد يتطلب تشريح multipالمبايض جنيه. وينبغي أن العملية كلها تستغرق أقل من 15 دقيقة.

ملاحظة: ومن المستحسن أن تشريح مبيض واحد من كل من الذباب عدة بدلا من تشريح كلا المبيضين أقل من الذباب لزيادة عدد ن من الذباب للتجربة.

ملاحظة: المعاملة الخشنة من ovariole سيؤدي في البويضات غير صحية ويمكن ان يؤدي الى القطع الاثرية في التجربة.

ملاحظة: سوف تبدأ البويضات لعرض التغييرات المظهرية بسبب التشديد على بعد 40 دقيقة يجري تشريح من المبيض (قارن 7E الشكل إلى F).

6. مرة واحدة ovarioles تكون في اتجاه مناسب (الشكل 3E)، واستخدام مسبار وملقط تشريح مغلقة لنقل فائض النسيج المبيضي للخروج من النفط. يمكن ان تزول هذه المواد من ملقط على منشفة ورقية.

4. عزل الفرد البيض مرحلة متأخرة الغرف (وفقا لهاء Gavis، جامعة برينستون)

1. مع زوج من الملقط في dominيد نملة، فهم الخلفي من المبيض معزولة، ويفضل من بقايا النسيج الضام. في حين الضغط على المبيض في مكان مع ملقط، ويعرض التحقيق تشريح في نهاية الخلفي من مبيض بالقرب من ملقط (الشكل 4A). تجنب أي ثقب غرف البيض بإضافة مسبار بين أواخر غرف بيضة المرحلة.
2. سحب الإبرة من خلال تشريح المبيض حتى خروجها في غرف مرحلة البيض في وقت مبكر (الشكل 4B). عندما يتم بشكل صحيح، سيقوم المسبار إزالة النسيج الضام عقد ovarioles وأواخر مرحلة غرف بيضة في مكان.
3. كرر الخطوة 4.2 حتى يتم نشر ovarioles بها على ساترة. ملاحظة: عندما لم تعد هناك غرف مكدسة بيضة على رأس كل منهما الأخرى، وهذه الخطوة هي كاملة.
4. باستخدام مسبار تشريح، فصل البويضات في وقت متأخر للسماح للتصوير بسهولة (الشكل 4C).

ملاحظة: ثقب بويضة في حين تشريح أواخر غرف بيضة المرحلة ليست كما يدين كما هو الحال مع تشريح أناndividual ovarioles لصغار مراحل.

ملاحظة: بالنسبة لغرف مرحلة البيض 14، استخدام الملقط لفهم الزوائد ظهري للتوجيه.

5. حقن إعداد

ملاحظة: للحصول على حقن البويضات مرحلة منتصف توجيه ovarioles عموديا على محور طويل من انزلاق الغطاء.

1. بدوره على التصوير المجهر [في حالتنا 1 كور DeltaVision من الدقة التطبيقية] وتحميل إعدادات التصوير المناسبة (الشكل 5A-B).
2. بدوره على جهاز حقن (الشكل 5C).
3. تحميل إبرة الحقن مع طرف التحميل (الشكل 5D-E). وينبغي طرد الحلول ليتم حقنه لفترة وجيزة على سرعة عالية لتجنب الودائع التي يمكن أن تسد إبرة الحقن.
4. نعلق إبرة حقن المحملة لحاقن. أن تحرص على تجنب كسر إبرة (الشكل 5F).
5. للمساعدة في مكافحة انسداد الإبر، ضع قطعة صغيرة من الزجاج 2x10 ملم من جرح أو كسر ساترةتي جانب واحد من انخفاض اسعار النفط الذي يحتوي على ovarioles. تأكد من تغطية هذه القطعة الزجاجية في مجال النفط. وهذا الزجاج يعمل على كبش طرف إبرة ضد لكسر أو مكافحة انسداد الإبرة.

6. حقن من الحمض النووي الريبي فلوري

قبل البدء: إعداد جهاز الحقن والصغيرة تتلاعب هذه الضوابط أن يتم وضع إبرة حقن أكثر من مركز مجال الرؤية.

1. تحميل عينة ليتم حقنه في المرحلة المجهر.
2. حدد هدف 20X. ويمكن أيضا أن أهداف تضخم أعلى أو أقل يتم استخدامها.

ملاحظة: في حال كنت تستخدم مرحلة الآلي مع قدرة نقطة زيارة فإنه من المستحسن للاحتفال كل مرحلة 8-9 البويضات للحقن قبل البداية. وهذا يسمح لزيارة سهلة وحقن البويضات المحدد.

3. خفض إبرة حقن حتى انها تمس النفط. مركز رأس إبرة خلال عدسة الهدف.
4. تحولبعيدا عن أضواء غرفة وتشغيل ضوء ساطع الميداني للمجهر. حدد النقطة الأولى (البويضة) على لائحة نقاط ملحوظ. بينما يبحث من خلال oculars، والتركيز على البويضة (الشكل 6A).
5. خفض الإبرة يدويا حتى يكون في نفس الطائرة من التركيز على البويضة والقادم واضحة للبويضة.
6. باستخدام عناصر التحكم مناور، نقل نقطة من إبرة الحقن حتى يتم داخل البويضة. حركة سريع طعن في كثير من الأحيان أكثر نجاحا من سلفة بطيئة. داخل مرة واحدة، إخراج كمية صغيرة من الإبرة وتقييم التأثيرات البصرية، كرر كما هو مطلوب. إذا كان حقن ناجحا، سيتم تشريد السيتوبلازم داخل البويضة، إذا لم يكن هذا واضح، وتكرار. ليس من الضروري أن الصورة في مضان لتحديد ما إذا كان قد تم حقن مادة. بعد الحقن، وإزالة الإبرة من داخل البويضة (الشكل 6B-G).
7. المبلغ الدقيق للحقن السائل من الصعب quantitate. لزيادة حجم حقن، adjuش الضغط أو الوقت من نبض حقن، كسر غيض إبرة لزيادة الانفتاح قليلا أو استخدام النبضات حقن المتكرر.

ملاحظة: عملية حقن كله ينبغي أن تأخذ أقل من 10 ثانية عندما تنفذ على الوجه الصحيح. وطعن واسعة النطاق أو العالقة مع إبرة داخل البويضة لتسفر عن اضرار فادحة في غرفة البيض.

8. قبل اختيار البويضة المقبل ملحوظ، ورفع ما يكفي من إبرة حقن عالية في مجال النفط حتى لا اتصل البويضات الأخرى في طريق السفر.
9. في البويضة الجديدة، كرر الخطوة 6.6. يستمر في هذا الطريق حتى يتم حقن كل البويضات المطلوبة.

ملاحظة: إذا ارتكب خطأ في حين طريق الحقن، والانتقال إلى بويضة المقبل ملحوظ. لا تضيعوا الوقت على البويضات التالفة.

ملاحظة: قد تصبح إبرة انسداد أثناء جلسة حقن. في هذه الحالة، تحريك الإبرة المتاخمة لقطعة من الزجاج المكسور في مجال النفط على ساترة. خفة دمح من الزجاج وإبرة في طائرة التنسيق نفسه، والكبش بلطف الإبرة في زجاج (الشكل 6H). اختبار التي يتم unclogged الإبرة من خلال الضغط على زر الحقن ومعرفة ما إذا أي سائل يخرج من رأس الإبرة.

10. عندما تم حقن جميع البويضات، يدويا نقل ما يصل إبرة، للخروج من النفط وتوجيهه للخروج من مسار شعاع للمجهر. تأكد من أن يكون في اتجاه آمن، لتجنب الأضرار التي تصيب العين.

ملاحظة: إذا كان لفترة طويلة من الزمن قد انقضت بين العزلة غرفة البيض وحقن البويضة، البويضات سيكون من الصعب حقن وعرض التغييرات المظهري المرتبطة بالإجهاد. يمكن أن تنشأ قضايا مماثلة مع معالجة الخام من البويضة أو حقن كميات الزائدة (مقارنة أرقام 6I، J، K).

7. ويعيش تصميم التصوير التجريبي

1. حدد بويضة 1 حقن من القائمة. اختبار أن حقن كان داخل البويضة بواسطة إطار واحد في التصوير مضان (أ ق في الشكل 6G).
2. تكوين المعلمات التجريبية، بما في ذلك: الطول الموجي الإثارة، مسار الانبعاثات، وقت الإثارة، Z المكدس والوقت بين المجموعات. ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول هذا، راجع بارتون R.، وآخرون. (2010) ^2.
3. جمع مجموعة البيانات.

8. ممثل النتائج

في المختبر توليفها اليكسا-546 grk RNA حقنها 1 Me31B :: GFP بيضة غرفة (7A الشكل). الحمض النووي الريبي يموضع إلى الأمامية الظهرية للبويضة، وتشكل غطاء حول النواة (7B الشكل). لمزيد من الأمثلة على توطين RNA رؤية ماكدوجال N.، وآخرون. (2003) ^11.

ولا يمكن تصوير البويضات مرحلة منتصف وأواخر التعبير عن بروتين فلوري المسمى (تاو، GFP، الشكل 7C) أو أنظمة علامات الحمض النووي الريبي (grk * mCherry، الشكل 7D) من دون حقن.

الشكل 1.

= "jove_content">

الشكل 2.

الشكل 3.

الشكل 4.

الشكل 5.

الشكل 6.

الشكل 7.

Discussion

حي التصوير الخلية هو فحص قوي لفحص العمليات الخلوية في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى المراقبة الميدانية بسيط مشرق، وبالإضافة إلى ذلك من تسميات فلوري إلى RNAs والبروتينات والاهتمام قد يؤدي إلى اختراقات كثيرة. هنا وقد أوجزنا بروتوكول للالبويضات التصوير المعيشة الفردية التي يمكن استخدامها في تركيبة مع فحوصات الجينية والبيوكيميائية.

في هذا البروتوكول، ونحن أيضا شرح كيفية التعامل مع التجربة الحية البويضات عن طريق الحقن. هناك احتمالات كثيرة للمادة لحقن، بما في ذلك في المختبر توليفها فلوري الحمض النووي الريبي وصفت لفحص قدرة هيكل الثانوي لتوطين RNA مباشرة (الكرة وديفيس، غير منشورة)، والأجسام المضادة التي تمنع وظيفة من البروتينات ^6. والعمل في المستقبل على الارجح ادخال مكونات غيرها من العلامات والآلات الخلوية إلى البويضات المعيشة مما يمكن اختبار الآليات الجزيئية.

تي "> الحفاظ على سلامة وصحة الأنسجة أمر ضروري عند العمل مع الخلايا الحية. في هذا البروتوكول، ونحن نشير إلى عدد من الخطوات التي يمكن أن تؤدي إلى الإجهاد للغرفة البيض. على سبيل المثال، على الرغم من كونها متفوقة النفط للتصوير، يمكن للثقافة موسعة في مجال النفط أن تؤدي إلى التأكيد على غرفة بيضة. هذا يمكن رصدها بسهولة في ظل التعرض لمجال مشرق من خلال دراسة مورفولوجية النووية والموقف، وغشاء الخلية البيضية التي من شأنها أن تشوه وفقاعة تحت الضغط (قارن 7E الشكل (بهيج) لFigure7F ( وأكد)). المرحلة غرف بيضة 9 مشاهدة RNA الترجمة والحدود هجرة الخلية أكثر من ¹² ساعات عدة. ومع ذلك، فإن مرحلة 7/8 غرفة بيضة ستبدأ في معرض الآثار السيئة في مجال النفط الكربون هالة بعد نحو 40 دقيقة من المبيض يتم إزالتها من ويمكن للإناث. بيضة في المرحلة المتأخرة الغرف، المرحلة 11 إلى 14 تتطور بشكل طبيعي سواء في النفط أو وسائل الإعلام مائي بسبب إفراز قشرة البيضة من الخلايا المسام في هذه المراحل ^13. لقد كان الريبوrted أن إضافة الأنسولين والمتوسطة الحشرات المائية قادرة على المحافظة على مرحلة 9 البويضات لمدة تصل الى 6 ساعات ¹⁴ و germaria تصل إلى 14 ساعات و ^15. في جميع الحالات، ينبغي تجنب المناورات العدوانية للغرفة البيض، كما أنه يؤكد على البويضات ويقلل من قدرتها على البقاء. التصوير أقل من البيض وغرف العناية لعلاج كل واحد بلطف أفضل وسيلة لضمان بقاء الأمثل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0)	Any Supplier		A good quality brush is important
Halocarbon Products Corporation, Series 95	Halocarbon Products Corp.		European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil.
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	"Biologie" tip is also good but more fragile
Dissecting probe	Fine Science Tools	10140-01
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ61
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)	European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Microscope- DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
Micromanipulator	Burleigh	Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo)
Injection apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips
Injection needle	Eppendorf	930000043	Different tips are better for different applications
Loading tips 20μl	Eppendorf	5242956.003
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192