Эндотелиальных клеток со-культуры посредником Созревание эмбриональных стволовых клеток человека в поджелудочной железы инсулин продуцирующих клеток в направленной дифференцировки подход

Summary

Данное исследование описывает направленной дифференцировки подход в стимулировании панкреатической дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека. Большое значение имеет вывод, что эндотелиальных клеток со-культуры посредником созревания человеческих эмбриональных стволовых клеток, полученных в поджелудочной предшественников инсулина экспрессирующие клетки.

Abstract

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) имеют две основные характеристики: они могут бесконечно размножаться in vitro в недифференцированном состоянии и они плюрипотентны, таким образом, имеют потенциал для дифференцировки в несколько линий. Такие свойства делают ЭСК чрезвычайно привлекательными для клеточной терапии и регенеративного лечения ¹. Однако для полной реализации его потенциала клетки должны быть дифференцированы в зрелые и функциональные фенотипы, что является сложной задачей. Многообещающим подходом к индуцированию клеточной дифференцировки является точная имитация пути органогенеза в условиях in vitro. Известно, что развитие поджелудочной железы происходит на определенных стадиях ², начиная с энтодермы, которая может развиться в несколько органов, включая печень и поджелудочную железу. Индукция энтодермы может быть достигнута путем модуляции узлового пути путем добавления активина ^А3 в комбинации с несколькими факторами роста ^4-7. Дефинитивные клетки энтодермы затем подвергаются поджелудочной инфекции путем ингибирования звукового ингибирования ежа, что может быть достигнуто in vitro путем добавления циклопамина ⁸. Созревание поджелудочной железы опосредовано несколькими параллельными событиями, включая ингибирование передачи сигналов Notch; агрегация предшественников поджелудочной железы в 3-мерные кластеры; индукция васкуляризации; и это лишь некоторые из них. Безусловно, наиболее успешное созревание in vitro клеток-предшественников поджелудочной железы, полученных из ЭСК, было достигнуто путем ингибирования передачи сигналов notch с помощью добавок DAPT ⁹. Несмотря на успех, это приводит к низкому выходу зрелого фенотипа с ограниченной функциональностью. Менее изученной областью является влияние передачи сигналов эндотелиальными клетками на созревание поджелудочной железы, которое все чаще оценивается как важный фактор, способствующий созреванию островков поджелудочной железы in vivo ^10,11.

В данном исследовании изучается такой эффект передачи сигналов эндотелиальными клетками при созревании человеческих клеток-предшественников поджелудочной железы, полученных из ЭСК, в инсулин-продуцирующие островковые клетки. Мы сообщаем о многоступенчатом протоколе направленной дифференцировки, при котором человеческие ЭСК сначала индуцируются в направлении энтодермы активином А вместе с ингибированием пути PI3K. Панкреатическая специфичность клеток энтодермы достигается путем ингибирования звуковой сигнализации ежа циклопамином наряду с индукцией ретиноидов путем добавления ретиноевой кислоты. Заключительная стадия созревания индуцируется передачей сигналов эндотелиальных клеток, достигаемой конфигурацией ко-культуры. В то время как несколько эндотелиальных клеток были протестированы в совместной культуре, в данной работе мы представляем наши данные с микрососудистыми эндотелиальными клетками сердца крысы (RHMVEC), в первую очередь для простоты анализа.

Protocol

1. Сотовые обслуживание

1. H1 чЭСК (WiCell) поддерживали на чЭСК квалифицированных матригелем лунок с mTeSR1 СМИ, со средствами массовой информации меняются каждый день. Лунки покрыты разбавленного раствора матригелем, получают путем добавления 300 мкл чЭСК матригелем в 25 мл DMEM: F12. 1 мл этого раствора матригелем был добавлен в каждую лунку с шестью лунками, или 400 мкл в каждую лунку добавляют по 12-луночного планшета и позволили, чтобы покрыть в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки механически пассировать на раскол соотношении 1:4, очищая колонии, как только они достигнут между 1 и 1,5 мм в диаметре.
2. RHMVEC (VEC технологий) была со....

Discussion

В поджелудочной развития, дифференциации клеток поджелудочной железы находятся в непосредственной близости с эндотелиальных клеток от аорты, кроме того, панкреатических островков густо васкуляризированной для содействия быстрому обмену глюкозы в крови и островок гормонов. Учитывая эти факты, это не удивительно, что эндотелиальные клетки играют важную роль в процессе органогенеза поджелудочной железы. В то время как значение эндотелиальных клеток поджелудочной железы при развитии все более и более высокую оценку, ее роль.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Концентрации
mTeSR1 (с дополнением)	Технологии стволовых клеток	5850
чЭСК квалифицированных матригелем	BD Biosciences	354277
DMEM: F12	Invitrogen	11330-032
MCDB-131	Invitrogen	10372019
MCDB-131 (завершен)	VEC технологии	MCDB-131
Дополнение B27	Invitrogen	17504044
Активин	R & D	338-AC	100ng/ml
Вортманнин	Invitrogen	W3144	1 мкм
KAAD-Cyclopamie	Sigma-Aldrich	C4116	0,2 мкм
All-транс-ретиноевой кислоты	Sigma-Aldrich	R2625	2 мкм
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942	30 мкм
Никотинамид	Sigma-Aldrich	N0636	10 мМ
Селенит натрия	Sigma-Aldrich	S5261	30 нМ
Инсулин	Sigma-Aldrich	I1882	25 мкг / мл
Трансферрина	Sigma-Aldrich	T8158	50 мкг / мл
ЭФР	R & D	236-EG	10ng/ml
EndoGro	VEC технологии	ENDOGRO	10 мг
Гепарин	Sigma-Aldrich	H3149	90μg/ml
Гидрокортизон	Sigma-Aldrich	H0888	1μg/ml
NucleoSpin РНК II	Macherey Nagel	740955
ImProm II обратной транскрипции системы	Promega	A3800
Блестящий II SYBR Green КПЦР мастер смеси	Straragene	600548
Sox17 козел поликлональных IgG	Санта-Крус	SC-17355	1/500
PDX1 коза поликлональных IgG	Санта-Крус	SC-14662	1/500
С-пептид кролика поликлональных	Сотовые сигнализации	4593	1/500
Alexa Fluor 488 осел анти-IgG кролика	Invitrogen	А-21206	1/1000
Alexa Fluor 647 осел анти-IgG козы	Invitrogen	А-21447	1/1000