본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.
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방법 논문
단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray
이 논문에서
요약
초록
본 연구에서는 특정 단백질의 당화 프로파일링이 가능한 당 결합 단백질 검출 기반의 다중 고처리량 항체 마이크로어레이 활용을 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 단백질의 당화는 단백질에서 발견되는 가장 일반적인 번역 후 변형으로, 단백질의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성의 다양화된 변형을 유도합니다. 당화 기전은 특히 질병의 진행과 악성 변형에 민감하기 때문에, 비정상적인 당화는 암 및 기타 질병의 조기 진단 마커로 인식되어 왔습니다. 그러나 단백질 당화를 연구하는 현재의 방법들은 일반적으로 너무 복잡하거나 비용이 많이 들어 대부분의 일반적인 실험실이나 임상 환경에서 사용하기 어려우며, 보다 실용적인 단백질 당화 연구 방법이 필요합니다. 본 연구에서 설명하는 새로운 프로토콜은 당 결합 단백질(GBP) 검출이 가능한 화학적 차단 항체 마이크로어레이를 활용하며, 단백질 당화 연구에 필요한 시간, 비용 및 실험 장비 요구 사항을 크게 줄여줍니다. 이 방법에서는 여러 개의 고정된 당단백질 특이적 항체를 마이크로어레이 슬라이드에 직접 프린팅하고 항체의 N-glycan을 차단합니다. 이렇게 차단 및 고정된 당단백질 특이적 항체는 마이크로어레이 슬라이드에 직접 도포된 복합 시료로부터 당단백질을 캡처하고 분리할 수 있습니다. 그 다음, 비오틴화된 렉틴 및 기타 GBP를 마이크로어레이 슬라이드에 도포하여 당 검출을 수행할 수 있으며, 결합 수준은 Dylight 549-Streptavidin을 사용하여 결정할 수 있습니다. 항체 패널의 사용과 여러 비오틴화 렉틴을 이용한 프로빙을 통해, 이 방법은 주어진 인간 또는 동물 시료에서 발견되는 서로 다른 단백질들의 효과적인 당화 프로파일을 구축할 수 있게 합니다.
서론
단백질의 가장 보편적인 번역 후 변형인 단백질 당화(Glycosylation)는 단백질의 물리적, 화학적, 생물학적 특성을 변화시키며, 다양한 생물학적 과정에서 핵심적인 역할을 합니다1-6. 당화 기제는 질병의 진행 및 악성 변형에 특히 민감하기 때문에, 비정상적인 당화는 암 및 기타 질환의 조기 진단 바이오마커로 인식되어 왔습니다7-12. 실제로 간세포암의 α-1 fetoprotein (AFP) L3 분획13-15 및 췌장암의 CA19916, 17와 같은 대부분의 현재 암 바이오마커들은 모두 당단백질의 비정상적인 글리칸 부분(glycan moieties)입니다. 그러나 단백질 당화를 연구하는 방법들은 복잡하여 일반적인 실험실 및 임상 환경에 적합하지 않았습니다. 최근 Chen et al.은 복잡한 시료 내 천연 당단백질의 고처리량 및 다중 프로파일 당화 분석을 위해 글리칸 결합 단백질(GBP) 검출법을 이용한 화학적 차단 항체 마이크로어레이를 개발하였습니다18. 이 친화성 기반 마이크로어레이 방법에서는 마이크로어레이 슬라이드 상에 고정된 여러 개의 당단백질 특이적 항체들이 복잡한 혼합물로부터 당단백질을 직접 포획 및 분리하며, 포획된 개별 단백질의 글리칸은 GBP에 의해 측정됩니다. 모든 일반적인 항체는 대부분의 GBP에 의해 인식될 수 있는 N-글리칸을 포함하고 있으므로, 이 방법의 핵심 단계는 항체의 글리칸이 GBP와 결합하지 못하도록 화학적으로 차단하는 것입니다. 이 절차에서는 빛을 차단한 소듐 아세테이트 완충액 내에서 NaIO4를 사용하여 항체 글리칸의 cis-디올 그룹을 먼저 알데히드 그룹으로 산화시켰습니다. 그 후 알데히드 그룹을 가교제인 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH)의 하이드라자이드 그룹에 접합시키고, 이어서 MPBH의 말레이미드 그룹에 디펩타이드인 Cys-Gly를 접합시켰습니다. 결과적으로 항체 글리칸의 cis-디올 그룹이 부피가 큰 비히드록실 그룹으로 전환되어, 렉틴 및 기타 GBP가 포획 항체에 결합하는 것을 방해하게 됩니다. 이러한 차단 절차를 통해 GBP와 렉틴이 포획된 단백질의 글리칸에만 결합하게 됩니다. 이렇게 화학적 차단을 거친 후, 혈청 시료를 항체 마이크로어레이와 반응시키고, 이어서 서로 다른 비오틴화 렉틴 및 GBP를 사용하여 글리칸을 검출한 뒤 Cy3-streptavidin으로 시각화하였습니다. 항체 패널과 다중 렉틴 프로빙을 병행 사용함으로써 주어진 시료 내 여러 단백질의 개별적인 당화 프로파일을 얻을 수 있습니다18-20. 이 방법은 여러 다른 실험실에서 성공적으로 사용되었습니다1, 7, 13, 19-31. 하지만 MPBH와 Cys-Gly의 안정성 문제, 그리고 이 방법의 복잡하고 긴 절차는 방법의 재현성, 효과 및 효율성에 영향을 주었습니다. 본 새로운 프로토콜에서는 MPBH와 Cys-Gly 모두를 훨씬 더 안정적인 시약인 글루탐산 하이드라자이드(Glu-hydrazide) 하나로 대체하였으며, 이를 통해 방법의 재현성을 크게 향상시키고 전체 절차를 단순화 및 단축하여 단 하루의 근무 시간 내에 완료할 수 있게 하였습니다. 이 새로운 프로토콜에서는 일반 실험실에서 일상적인 단백질 당화 연구에 쉽게 도입할 수 있는 상세한 절차와 재현 가능하고 반복 가능한 결과를 얻는 데 필요한 기술을 설명합니다.
프로토콜
1. 분석을위한 항체 Microarray 인쇄
- 0.5 MG / 인산염 완충 식염수, 산도 7.2 (PBS)의 ML에 모든 항체를 희석.
- 384 잘 소스 판으로 나누어지는 각 항체의 40 μl합니다.
- Scienion의 sciFLEXARRAYER의 microarrayer에 384 잘 소스 판을로드합니다.
- 목표로 microarrayer에 20의 PATH 환경 microarray 슬라이드를로드합니다.
- 27 항체 및 제어 단백질이 9x9 패턴 (그림 1E, 1F)에서 세중의에서 발견되는 48 동일 subarrays를 인쇄할 microarrayer를 설정합니다.
- 항체 microarray 슬라이드를 인쇄 microarrayer를 시작합니다.
- 항체 microarray 슬라이드를 수집하고, 건조가있는 슬라이드 카세트에 그들을 저장합니다. 진공 실러 (Foodsaver)를 사용하여 비닐 봉투에 카세트를 밀봉 진공 청소기.
- 4에 ° C 냉장고에 밀폐 microarray 슬라이드를 저장합니다.
2. 화학적 GBP을 방지하기 위해 항체 Microarray를 차단캡처 항체에 바인딩 <....
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토론
1. 대상 단백질과 캡처 항체 선택
항체 microarray 분석에 앞서, 몇 가지 시약 및 재료는 고려가 필요하고 준비가되어 있습니다. glycan 프로 파일링 또는 glycan의 biomarker 검사, 당단백질 후보에 대한 특정 항체의 패널에 대한 항체 microarray를 디자인하기 위해서는 문학에 또는 이전 결과에 따라 결정되어야한다. 이러한 항체는 일반적으로 이러한 R & D 시스템 등 IgGs 등 다양한 업체에서 구입했습니다 이전 테스트를 몇 가지 IgM과 IGE 완전히 화학적 변형 후에 그들의 항원 결합 동질성을 잃을 수도 보여준 이후 캡처 항체를 선호하고 있습니다.
2. 디자인 및 항체 microarray의 제조
항체 microarray의 제조는 전문적이고 비싼 microarrayer, 그리고 작업에 대한 잘 훈련된 인력이 필요한 단계는 선택 사항입니다. 그러나.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 간염과 바이러스 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 신분증 | 시약의 이름 | 약어 | 회사 | # 카탈로그 |
| L1 | Biotinylated Concanavalin | ConA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L2 | Biotinylated Sambucus Nigra의 렉틴 | SNA | 벡터 연구소 | B-1305 |
| L3 | Biotinylated 렌즈 Culinaris Agglutinin | LCA | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L4 | Ricinus Communis Agglutinin 봐도 Biotinylated | RCA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| 5 번 | Biotinylated Aleuria Aurantia의 렉틴 | AAL | 벡터 연구소 | B-1395 |
| L6 | Biotinylated Erythrina Cristagalli의 렉틴 | ECL | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L7 | Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 II | GSL II | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L8 | Biotinylated 밀 배아 Agglutinin | WGA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L9 | Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Erythroagglutinin | PHA-E | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| 10 파운드 라니 | Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Leucoagglutinin | PHA-L | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L11 | Biotinylated 땅콩 Agglutinin | PNA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L12 | Pisum Sativum Agglutinin을 Biotinylated | PSA | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L13 | Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | DBA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L14 | Biotinylated 흰독말풀의 가시독말풀의 렉틴 | DSL | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L15 | Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | SJA | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L16 | Biotinylated 대두 Agglutinin | SBA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L17 | Biotinylated Solanum Tuberosum (감자) 렉틴 | STL | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L18 | Biotinylated Griffonia (밴드eiraea) Simplicifolia의 렉틴 I | GSL 전 | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L19 | Biotinylated Vicia 비오의 렉틴 | VVL | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L20 | Biotinylated Lycopersicon Esculentum (토마토) 렉틴 | LEL | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L21 | Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin 전 | UEA 전 | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L22 | Biotinylated Jacalin | JACALIN | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| A1 | 염소 F (AB ') 2 조각 반 인간 IgM, Fc5μ 항체 | IgM | 잭슨 Immuno 연구 | 109-006-129 |
| A2 | 돈키 F (AB ') 2 Frag 안티 - 인간 IgG (H + L)tibody | AB1 | 잭슨 Immuno 연구 | 709-006-149 |
| A3 | 마우스 안티 인간 IgG F (AB ') 2 단클론 항체 | AB3 | 잭슨 Immuno 연구 | 209-005-097 |
| A4 | 염소 안티 인간의 알파 2 macroglobulin polyclonal 항체 | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | 토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체 | A1AT | 리 Biosiences | CA1T-80A |
| A6 | 마우스 안티 인간 알파-1-antitrypsin 단클론 항체 | A1AT | 시그마 알드리치 | SAB4200198 |
| A7 | 토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체 | 주문 | NeoMarkers | RB-367-A1 |
| A8 | 래빗 안티 인간알파-1-antichymotrypsin polyclonal 항체 | 주문 | 피셔 과학 | RB9213R7 |
| A9 | 마우스 안티 인간 트랜스페린 단클론 항체 | 트랜스페린 | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | 토끼 반 인간 트랜스페린 polyclonal 항체 | 트랜스페린 | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | 염소 안티 인간 apolipoprotein J polyclonal 항체 | ApoJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | 마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체 | GP73 | 애보트 | 14H4-23 |
| A13 | 마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체 | GP73 | 산타 크루즈 생명 공학 INC | SC-101275 |
| A14 | 토끼 반 인간 알파-1 fetoprotein polyclonal 항체 | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
| A15 | 마우스 안티 인간의 알파 페토 프로테인-1 단클론 항체 | AFP | 피츠제럴드 | 10-A05A |
| A16 | 마우스 안티 인간 hemopexin 단클론 항체 | Hemopexin | Assaypro | 60190-05011 |
| 대답 17 | 마우스 안티 인간 glypican-3 (1G12) 단클론 항체 | GPL3 | 산타 크루즈 바이오 | SC-65443 |
| 대답 18 | 마우스 안티 인간 Kininogen (LMW) 단클론 항체 | Kininogen | Assaypro | 20333-05011 |
| 대답 19 | 토끼 반 인간 MMP-21 단클론 항체 | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | 마우스 안티 인간 CEACAM-1 단클론 antibodY | CEACAM | R & D 시스템 | MAB1180 |
| 대답 21 | 쥐 안티 인간 DPPIV/CD26 단클론 항체 | DPPIV | R & D 시스템 | MAB22441 |
| 대답 22 | 마우스 안티 인간 PIVKA II 단클론 항체 | PIVICA | 크리스탈 화학 | 8040 |
| 대답 23 | 마우스 안티 carcinoembryonic 항원 | CEA | 미국 생물학 | C1300 |
| 대답 24 | 마우스 방지 CA125 암 항원 | CA125 | 미국 생물학 | C0050-01D |
| 대답 25 | 마우스 방지 CA19-9 암 항원 | CA19-9 | 미국 생물학 | C0075-18 |
| 대답 26 | 마우스 방지 루이스 X 단클론 항체 | 루이스 X | Calbiochem | 434,631 |
| 바이오 | Biotinylated BSA (긍정적인 제어) | 바이오 | 집에서 만든 | N / A |
이 프로토콜에서 사용 lectins 및 항체의 표 1.리스트.
| 시약 S / 장비의 명칭 | 회사 | 카탈로그 번호 |
|---|---|---|
| 비 접촉 microarrayer | BioDot INC | sciFLEXARRAYER |
| 384 microplate | 어부 | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Ultrathin nitrocellulose coate microarray는 슬라이드 | Gentel | PATH |
| 슬라이드 Imprinter (옵션) | 젤 회사 | WSP60-1 |
| 흔드는 사람 | 어부 | 15-453-211 |
| 원심 분리기 | Eppendorf | 5804 000.013 |
| 이동식 랙과 슬라이드 씻는 세면대 / 슬라이드 염색법 요리 | 어부 | 08-812 |
| 슬라이드 배양 챔버 / 현미경 슬라이드 박스 | 어부 | 03-448-5 |
| Brij 35, 물 30 W / V % 용액 | Acros의 생명체 | AC32958-0025 |
| 십대 초반-20 | 어부 | P337-100 |
| 나트륨 Periodate (NaIO 4) | 시그마 | 311,448 |
| L-글루탐산 γ-히드라 지드 | 시그마 | G-7257 |
| 나트륨 아세테이트 무수 (CH 3 COONa) | 시그마 | S2889 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Lampire 생물학 실험실 | 7,500,804 |
| 인산 버퍼 식염수 (PBS) (10X) | Denville 과학 | CP4390-48 |
| Dylight 549 복합 NeutrAvidin | 써모 | 22,837 |
| 테아제 억제제 칵테일 정제 | 로슈 | 4693159001 |
| ChromPure 인간 IgG, FC 조각 | 잭슨 Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure 인간 IgG, 전체 분자 | 잭슨 Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure 마우스 IgG, 전체 분자 | 잭슨 Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure 마우스 IgG, FC 조각 | 잭슨 Immunoresearch | 015-000-008 |
| ChromPure 토끼 IgG, 전체 분자 | 잭슨 Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure 돈키 IgG, 전체 분자 | 잭슨 Immunoresearch | 017-000-003 |
| Microarray 스캐너 | Tecan | LS는 리로디드 |
이 프로토콜에 사용되는 장비와 시약의 표 2.리스트.
참고문헌
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to....
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재인쇄 및 허가
