光による小さなGTPase活性の時空間制御の方法が記載されている。このメソッドは、ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロと写真ケージシステムに基づいています。光照射の最適化は、細胞内レベルでの低分子量GTPaseの時空間時間的制御の活性化を可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
大きな時空間精度で小さなグアノシントリホスファターゼのRhoファミリー（GTPアーゼ）の動的な制御は、様々な細胞機能やイベントの1、2のために不可欠です。その時空の動的な性質は、リアルタイム3それらの活性と局在の可視化によって明らかにされています。分子レベルでの多様な細胞機能における役割のより深い理解を得るために、次のステップは、正確な細胞内局在場所とタイミングでタンパク質の活動の摂動である必要があります。
（1）ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロおよびラパマイシン（2）写真ケージング方法：この目標を達成するために、我々は、光誘起、二つの手法を組み合わせることにより、低分子量GTPaseの時空間、時間的に制御されたアクティベーションの方法を開発した。ラパマイシン媒介FKBP-FRBのヘテロを使用すると、我々は急速に低分子量GTPase includiの活性化または不活性化を誘導するための方法を開発しましたngのRAC 4、ラパマイシンは、FRBが固定されている細胞膜に、FKBP-融合GTPアーゼ、またはそれらの活性化の移行を誘導するCdc42の4、RhoAの4とRasの5。このヘテロシステムと結合するために、我々はまた、ラパマイシン類似体の写真ケージシステムを開発した。写真ケージド化合物は、その活動ケージング基として知られている光開裂性保護基で抑制されている小分子である。完全にヘテロの活性を抑制するために、我々はセル6内の化学dimerizerとして事実上のバックグラウンド·アクティビティにつながる、結果として大規模な複合体が細胞膜を通過できないような高分子につながれているケージラパマイシンを設計しました。 図1は、我々のスキームを示していますシステム。これら二つのシステムの組み合わせにより、我々は局所的に数秒の時間スケールで形質膜へのRac活性化を採用し、細胞内レフで光誘起Racの活性化を達成しましたエル6。
プロトコル
1。プラスミドDNAのトランスフェクション
- プラスミドDNAを追加し、0.5μgの膜係留FRB（以下、LDRと呼ばれる）と0.5μgのFKBP-Tiam1（T-細胞リンパ腫の浸潤や転移を誘発するタンパク質1：RAC活性剤）37.5μLのdH 2 Oに蛍光タンパク質でタグ付け1μlのトランスフェHDを追加します。
- 20分間室温でボルテックスし、インキュベートします。一方、ステップ1.3から1.8に進みます。
- 50μlのポリ-D-リジンで8ウェルチャンバーの各ウェルを洗浄します。
- のdH 2 Oで各ウェルの中央を洗う
- 80から85パーセントコンフルエントNIH-3T3細胞をトリプシン処理し、10 mlの培地（10％FBSを含むDMEM）に希釈する。
- 懸濁液375μlを削除し、3分間1750 rpmで遠心します。
- ペレットを乱さないように注意しながら、培地を吸引除去する。
- DMEMのw / 10％FBSを再懸濁し、750μlを添加します。
- のdH 2 O / DNA /トランスフェHDソリューションに細胞懸濁液を加え、穏やかに混ぜる。
- 250を追加します。各ウェルに細胞/ DNA懸濁液の液（3ウェルにいっぱいになります）。
- 15から18時間のために°C、5％CO <....
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ディスカッション
我々は、秒の時間スケールでの正確な細胞内の場所でのRho GTPase活性を操作するために、FKBP-FRBヘテロシステムと小説ケージド化合物を一緒に採用してテクニックを説明します。
現在のアプローチの3つの制約があります。方法は、プラズマ膜を横切ってdimerizerの拡散を防止または許可に基づいているので、まず、ターゲット細胞の位置は、原形質膜またはその付近である必要があります。 CRBの化学構造のさらなる最適化は、化合物は光照射するまでの二量体化を誘導することなく細胞を入力することが可能になります。そのようなdimerizerでは、我々は理論的にはどこでも細胞内シグナル伝達分子の活性を操作することができます。第二に、化学dimerizers、FKBP-FRBの二量体複合体、またはアクティブに内因性のシグナル伝達分子の分子拡散が大幅に意図した効果の正確な閉じ込めに影響を与えることができます。この効果は、特に発音されます後の時点で、UV照射（例えば、ビーム幅、エネルギー、ビームモード（連続対パルス）など）と関係する化合物の拡散係数に関連付けられたパラメータに依存しています。これら.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
本研究では、NIHの研究資金（TIへDK090868とGM092930）によってサポートされていました。ケージラパマイシンアナログの保留中の特許があります。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/装置の名前 | 会社 | カタログ番号 | |
| ラパマイシン | Tecoland | RAPA99 | |
| トランスフェHD | ロシュ社 | 04709691001 | |
| アビジン | シグマ | A9275-10mgの | |
| DMSO | シグマ | D2650-5X5ML | |
| サイズ排除カラム | GEヘルスケア | スピントラップG-25 | |
| ガラス底8ウェルチャンバー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12-565-47 | |
| 倒立蛍光顕微鏡 | ツァイス | Axiovert200M | |
| 紫外線LED光源 | ラップオプトエレクトロニクス | UVILED | |
| 共焦点回転するディスク | 横河電機（株） | CSU10 | |
| CCDカメラ | 浜松ホトニクス | ORCA-ER | |
| 100倍対物レンズ | ツァイス | プランアポクロマート |
CRBの合成スキーム（著作権ACS2011）6
合成条件：（a）BnBr、K 2 CO 3、DMF（b）にf.HNO 3、AcOHで（c）にTFA（d）のプロパルギル-Brを、K 2 CO 3、DMF、（e）のグリセロールは、猫。 PTSA、トルエン（F）のNaBH 3 CN、TiCl 4の 、MeCN中（G）のTf 2 O、ピリジン（h）のメタノール塩酸は、（i）のLiAlH 4、THF（J）TSCL、ピリジンのCH 2 Cl 2（K）はNaN 3、DMF（L）8、2,6 -ジ-t-ブチル、CH 2 Cl 2中 （M）13日のCuSO 4、アスコルビン酸、2 -プロパノール、H 2 O、CH 2 Cl 2で 。
参考文献
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M.
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再版と許可
