Мы демонстрируем FRET между сопряженными полидиацетилена полимера (PDA) и флуорофор прикреплены к поверхности липосом для PDA зондирования биомолекул. PDA липосомы также содержатся молекулы-рецепторы на своей поверхности для биомолекул, которые будут использоваться в качестве зондов. Лиганд-рецепторного взаимодействия приводят к изменениям в эффективности FRET между флуорофором и КПК, который является основой чувствительный механизм.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мониторинг в реальном времени лиганд-рецепторных взаимодействий с флуоресцентной резонансного переноса энергии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
FRET является процесс, при котором энергия не является радиационно передается от возбужденной молекулы донора основного состояния молекулы акцептора через дальний диполь-дипольных взаимодействий 1. В настоящее зондирования анализа, мы используем одно интересное свойство PDA: синий сдвиг в UV-Vis электронном спектре поглощения КПК (рис. 1) после аналита взаимодействует с рецепторами прикреплены к PDA 2,3,4,7. Этот сдвиг в спектре поглощения PDA обеспечивает изменения спектрального перекрытия (J) между КПК (акцептор) и родамина (донора), что приводит к изменениям в FRET эффективности. Таким образом, взаимодействие между аналита (лигандов) и рецепторы обнаружены с помощью FRET между донором флуорофоров и КПК. В частности, мы показываем зондирования молекулы белка стрептавидина модели. Мы также демонстрируют ковалентной привязки бычьего сывороточного альбумина (БСА) в липосомы поверхность с FRET механизм. Эти взаимодействия между тОн бислой липосом и молекул белка может быть воспринято в режиме реального времени. Предлагаемый метод является общим методом для измерения небольших химических и биохимических больших молекул. С флуоресценции является принципиально более чувствительны, чем колориметрии, предел обнаружения анализ может быть в суб-наномолярных диапазоне или ниже 8. Кроме того, КПК может выступать в качестве универсального акцептора в FRET, что означает, что несколько датчиков могут быть разработаны с КПК (акцептор) функционализированные с донорами и различные рецепторы прикреплены к поверхности липосом PDA.
Протокол
А. Синтез и характеристика PDA Липосомы 4,5,6
Примечание 1: Защита PDA решение от света, используя упаковку из алюминиевой фольги на каждом контейнере на протяжении всего экспериментального этапа.
Примечание 2: два различных набора раствор липосом (B и C), были подготовлены следующие процедуры (синтез и характеристику PDA липосомы).
1. Синтез N-гидроксисукцинимида Diacteylene (NHS-ВКПДР)
- Для подготовки липосомы, важным элементом ВКПДР-NHS не требуется. Мы синтезировали ВКПДР-NHS, используя следующие процедуры:
- Добавить 10,12-pentacosadiynoic кислоты (ВК....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы провели избирательного связывания остатка лизина белка на поверхности липосомы использованием NHS-амин реакции. Это FRET метода, основанного на это способна в режиме реального времени мониторинг биотин-стрептавидина и белка (БСА) привязку к поверхности липосомы. Подобная процедура может быть применена для изучения обязательных динамики различных взаимодействий белков с их избирательной рецепторов. Существует гибкость в выборе флуорофоров, что обеспечит изменениях в J значения в зависимости от спектральных ха.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Финансовая поддержка для этой работы была предоставлена через Национальный научный фонд, Национальный институт здоровья (NIH), материалы технический центр (MTC) и ОРДА в SIUC. Мы благодарим NSF на получение гранта (CHE-0959568) на приобретение FE-SEM. Мы хотели бы поблагодарить профессора Мэтью McCarroll за полезные обсуждения. Юлия Рейес хотел бы поблагодарить COLCIENCIAS, Колумбийский университет агентства и Pedagogica у Tecnologica Колумбии за ее стипендии и финансовую поддержку.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| 10,12-pentacosadiynoic кислоты (ВКПДР) | GFS химических веществ | 3261 | Светочувствительный |
| N-гидроксисукцинимида (NHS) | Acros Organics | 157270250 | Влагочувствительные |
| 1 - (3 - (диметиламино) пропил)-3-этилкарбодиимида (EDC) | Chem-Impex International | 00050 | |
| 1,2-димиристоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC) | Avanti Polar липиды | 850345P | |
| Родамина с метками говядина Serит альбумина (БСА-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-диолеоил-Sn-глицеро-3-phosphoethanolamine-N-(биотинил) (биотин-DOPE) | Avanti Polar липиды | 870282 |
Ссылки
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
