بروتوكول يصف نظام فعال وقابلة للتكرار نموذج لدراسة فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) الكمون وتنشيط. الفحص توظف متجانسة الثقافات الخلايا العصبية متعاطف، ويسمح للتشريح الجزيئية للفيروس الخلايا العصبية التفاعلات باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات بما في ذلك تدخل الجيش الملكي النيبالي والتعبير من البروتينات المؤتلف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) يضع العدوى الكامنة مدى الحياة في الخلايا العصبية الطرفية. هذا خزان كامن هو مصدر الأحداث المتكررة التي تكفل إعادة تنشيط النقل وتسهم في المرض السريري. الأدوية المضادة للفيروسات الحالية لا تؤثر على خزان كامنة وأنه لا توجد لقاحات. في حين أن تفاصيل الجزيئي للتكرار التحللي هي جيدة تتميز، وآليات السيطرة على كمون في الخلايا العصبية لا تزال بعيدة المنال. مشتق من فهمنا الحالي للكمون من الدراسات المجراة في استخدام النماذج الحيوانية الصغيرة، التي لا غنى عنها لتحديد الاحتياجات الجينات الفيروسية ودور الاستجابات المناعية. ومع ذلك، فإنه من المستحيل التمييز بين آثار محددة على علاقة الفيروسات الخلايا العصبية من عواقب وأعم من العدوى بوساطة خلايا المناعة أو الدعم غير العصبية في الحيوانات الحية. وبالإضافة إلى ذلك، التجارب على الحيوانات غير مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، ومحدودة من حيث الخيارات المتاحة لمعالجة مضيفالعمليات. للتغلب على هذه القيود، وهناك حاجة ماسة إلى نظام الخلايا العصبية فقط أن يستنسخ في خصائص الجسم الحي من الكمون وإعادة تنشيط لكنه لم يقدم فوائد زراعة الأنسجة من حيث التجانس وسهولة الوصول إليها.
نحن هنا يقدم في المختبر باستخدام نموذج مثقف الخلايا العصبية متعاطف الأولية من العقد الفئران عنق الرحم متفوقة (SCG) (الشكل 1) لدراسة HSV-1 الكمون وتنشيط يلائم معظم إن لم يكن كل من المعايير المطلوبة. بعد القضاء على الخلايا غير العصبية، يصاب شبه متجانسة TrkA + الثقافات الخلايا العصبية مع HSV-1 في وجود الأسيكلوفير (ACV) لقمع تكرار التحللي. التالية ACV إزالة، غير منتجة HSV-1 الإصابات التي تعرض بأمانة وضعت بصمات بكفاءة مقبولة من الكمون. والجدير بالذكر أن mRNAs التحللي، والبروتينات، والفيروسات المعدية تصبح غير قابلة للكشف، حتى في حالة عدم وجود اختيار، ولكن استتار المصاحب لنص (LAT) صريحةايون استمرت في نوى الخلايا العصبية. تتم المحافظة على الجينوم الفيروسي في عدد نسخة من متوسط 25 في الخلايا العصبية، ويمكن أن يكون ذلك حافزا لتكرار منتجة عن طريق التداخل مع PI3-كيناز / AKT إشارات أو انسحاب بسيط من عامل نمو الأعصاب 1. والمؤتلف HSV-1 EGFP ترميز تنصهر في Us11 بروتين فيروسي التحللي يوفر وظيفية، في الوقت الحقيقي وعلامة للحصول على النسخ الناتجة عن إعادة تنشيط أن كميا بسهولة. بالإضافة إلى العلاج الكيميائي، ويمكن منهجيات الوراثية مثل تسليم الحمض النووي الريبي التدخل أو الجينات النواقل lentiviral تطبيقها بنجاح على نظام السماح للدراسات الآلية التي من الصعب جدا، إن لم يكن مستحيلا، في الحيوانات. وباختصار، فإن SCG المستندة إلى HSV-1 كمون / تنشيط نظام يوفر قوية، وأداة ضرورية لكشف الآليات الجزيئية التي تتحكم في HSV1 الكمون وتنشيط الخلايا العصبية في، لغزا محيرا منذ وقت طويل في علم الفيروسات التي قد تقدم حلا رؤى جديدة لتطوير علاجات جديدة هدف تيكان كامنا خزان هربس.
البروتوكول
1. العزلة والثقافة من الخلايا العصبية SCG من أجنة الفئران
لتوفير سياق مفيد لفهم هذا البروتوكول، ومناقشة شاملة للأدب في وقت سابق ان وضع أساليب للثقافة العصبية SCG، بما في ذلك أساسا لثقافة SCG في المختبر، ركائز لوحة طلاء، ومكونات مصل الدم خالية من وسائل الإعلام، فإن ويشار إلى القارئ إلى مراجع 2-4.
- وقد أجريت على استخدام الفئران كمصدر للخلايا العصبية SCG فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة في إطار بروتوكول النشطة التي وافق عليها رعاية الحيوانا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذه الثقافة الخلايا العصبية الأولية ونظام عدوى يوفر طريقة بسيطة وفعالة لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء HSV-1 الكمون وتنشيط. نظام يلخص بأمانة بصمات المقبولة من الكمون المحددة في كل من الإصابات البشرية والحيوانات الحية من النماذج. عندما يكون الفيروس كامنا في الثقافات SCG، لا يمكن أن الجسيمات الفيروسية المعدية ومنتجات يتم الكشف عن الجينات التحللي. فقط منتج الجين الفيروسي الكشف عنها في الخلايا العصبية خفية المصابة هي نسخة LAT غير الترميز، الذي يتراكم داخل النوا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر المقيمين على اقتراحاتهم مدروس التي ساعدت على تحسين هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المنح لMVC (NS21072، HD23315)، ACW (GM61139، S10RR017970) والدردشة (AI073898، GM056927) من المعاهد الوطنية للصحة. وأيد عضو الكنيست في جزء من منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (5T32 AI007180).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكاشف | شركة | كتالوج # | تعليقات |
| 70μm النايلون فلتر (مصفاة الخلية) | العلوم البيولوجية دينار بحريني | 352350 | |
| 1X هانك في محلول ملحي متوازن (HBSS - / -) | إينفيتروجن | 14175 | ث / س CaCl 2 و 2 MgCl |
| 1X وسائل الإعلام الأساسية الدنيا (MEM) | إينفيتروجن | 11095-080 | |
| 5-الفلورية 2'-deoxyuridine | سيغما | F0503 | إعداد الأوراق المالية 20 ملم في MEM 1X؛ مخزن في -20 درجة مئوية |
| 96-جيدا لوحات مسطحة القاع TC جيد | كورنينج | 3599 | |
| الأسيكلوفير | Calbiochem | 114798 | إعداد الأوراق المالية 31 ملم في DMSO؛ مخزن في -20 درجة مئوية |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | إعداد الأوراق المالية 10 ملم في DMSO؛ مخزن في -20 درجة مئوية |
| B-27 الملحق | إينفيتروجن | 17504-44 | |
| كولاجيناز | سيغما | C2674 | إعداد 10 ملغ / مل الأوراق المالية في HBSS - / -؛ مخزن في -20 درجة مئوية |
| D-(+)، الجلوكوز | سيغما | G6152 | إعداد الأوراق المالية 40٪ في H 2 O، فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجة مئوية |
| L-الجلوتامين | إينفيتروجن | 25030-081 | |
| Laminin | سيغما | L2020 | إعداد 1 ملغ / مل في الأوراق المالية H 2O؛ السريع تجميد 20 ميكرولترaliquats ومخزن في -80 درجة مئوية. المخفف إلى 2 ميكروغرام / مل اضرب العمل. في عقيم O 2 H |
| Leibovit'z L-15 وسائل الاعلام | إينفيتروجن | 11415 | |
| عامل النمو العصبي | هارلان مختبرات | BT.5017 | تجهيز 50 ميكروغرام / مل الأوراق المالية في HBSS - / -؛ مخزن في -80 درجة مئوية |
| Neurobasal المتوسطة | إينفيتروجن | 12348 | |
| Phosphonoacetic حامض (PAA) | سيغما | P6909 | إعداد 75 ملغ / مل الأوراق المالية في H 2 O، متجر في -20 درجة مئوية |
| بولي-D-يسين هيدروبروميد | سيغما | P0899 | إعداد 20 ملغ / مل الأوراق المالية في H 2 O، متجر في -20 درجة مئوية |
| الجرذ الذيل الكولاجين | ميليبور | 08-115 | تركيز يختلف كثيرا مع العرض؛ مخزن في 4 درجات مئوية، وتمييع إلى 0.66 ملغ / مل اضرب العمل. في عقيم O 2 H |
| Trichostatin A | سيغما | T8552 | 1 إعداد الأوراق المالية ملم في DMSO؛ مخزن في -20 درجة مئوية |
| التربسين 2.5٪ | إينفيتروجن | 15090-04 |
المراجع
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
