本方法描述了可生物降解聚酸酐薄膜和纳米颗粒库的组合合成，以及从这些库中高通量检测蛋白质释放的技术。
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摘要
摘要
聚酸酐是一类具有良好生物相容性和药物递送能力的生物材料。尽管过去已广泛采用传统的单一样品逐一合成方法对其进行研究，但近年来发展出一种高通量的新方法，能够实现大量聚酸酐库的合成与测试1。该方法将显著提高这些生物材料在药物和疫苗递送应用中的优化与设计效率。本文所述方法包括可生物降解聚酸酐薄膜和纳米粒子库的组合合成，以及对这些库中蛋白质释放的高通量检测。在此由机器人操作的方法（图1）中，线性执行器和注射泵由LabVIEW控制，从而实现无需人工干预的自动化流程，避免人为误差。此外，该方法能够快速制备微尺度聚合物库，在减小批次规模的同时，生成多变量的聚合物体系。这种组合合成策略可在合成一种聚合物所需的时间内，完成多达15种不同聚合物的合成。另外，通过将聚合物库溶解于溶剂后沉淀至非溶剂中（用于制备纳米粒子）或通过真空干燥（用于制备薄膜），可将组合聚合物库加工成空白或负载蛋白质的几何结构，如薄膜或纳米粒子。当将荧光染料标记的蛋白质载入聚合物库后，可采用基于荧光的检测方法对蛋白质释放动力学进行高通量评估（图2和图3），如先前所述1。该组合平台已通过传统方法验证2，并对聚酸酐薄膜和纳米粒子库进行了1H NMR和FTIR表征。这些库已系统筛选了蛋白质释放动力学、稳定性及抗原性；体外细胞毒性、细胞因子产生、表面标志物表达、黏附、增殖与分化；以及体内生物分布和黏膜黏附性能1-11。本文开发的组合方法实现了高通量聚合物合成及蛋白质负载纳米粒子与薄膜库的制备，进而可对其进行体外和体内筛选，以优化生物材料性能。
方案
1. 组合聚合物文库合成（聚合物化学结构变化）——机器设置见图1
- 将每种单体溶解于适当的溶剂中（浓度 = 25 mg/ml），并分别装入10 cc气密式注射器中。
- 将耐溶剂的鲁尔锁毛细管连接至每个注射器的末端。
- 将注射器放置在注射泵（New Era Programmable Syringe Pumps）上，并固定到位。
- 将线性驱动器（Zaber）设置至起始位置。
- 使用铁架台夹具，将两根毛细管的末端定位至用于单体沉积的起始样品瓶/孔中。
- 启动LabVIEW程序，该程序根据目标共聚物组成，将不同体积的每种单体泵入各个孔中。程序通过指令Z轴驱动器将毛细管下降至样品瓶/孔内，随后控制各泵 dispensing 所需体积来实现此操作。接着，程序指令Z轴驱动器返回初始位置，并控制X轴和Y轴驱动器移动至下一个样品瓶/孔的位置。此过程持续进行，直至每个孔中均沉积了目标体积的单体。
- 完成单体沉积后，将多孔板或多瓶单体库转移至预热的真空烘箱中，在缩合聚合反应期间保持真空状态进行孵育。对于CPH:SA的合成，反应条件为180 °C、0.3 torr，持续1.5小时，但不同聚合物体系的反应条件会有所差异。
2. 组合式空白与载药聚合物纳米颗粒及薄膜文库的制备——参见图1的机器人装置....
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讨论
了解必要的合成条件和玻璃化转变温度（Tg聚合物合成的特性对于文库制备至关重要。如果 Tgs 低于室温时，纳米颗粒的制备步骤可能需要在低于 T 的受控温度环境中进行g 聚合物的。此外，需注意确保所有接触高温和溶剂的设备均能耐受相应条件。本方案中的多个参数可进行调整（即温度、真空度、孵育时间、溶剂、非溶剂、聚合物浓度、溶剂与非溶剂比例等）以适应不同聚合物体系的合成或颗粒/薄膜制备。在某些情况下，纳米颗粒在溶剂中长时间内（足以通过真空干燥去除溶剂）不稳定，因此可采用两种替代的溶剂去除方法：1）将颗粒缓慢离心，倾去上清液溶剂，随后干燥剩余颗粒；或 2）通过真空过滤分离颗粒，然后进行干燥。在制备空白或载蛋白纳米颗粒/薄膜后，可进行高通量表征或测试，以筛选生物材料在蛋白、细胞或宿主相互作用方面的性能。该高通量方法可实现针对特定应用的生物材料性能快速优化。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢ONR-MURI奖（NN00014-06-1-1176）和美国陆军医学研究与物资司令部（项目编号W81XWH-10-1-0806）提供的经费支持。本研究工作得到了美国国家科学基金会（项目编号EEC 0552584和0851519）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电动XYZ载物台：3台T-LSM050A，每轴行程50 mm | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 单通道注射泵 | New Era泵系统 | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* 无沿可重复使用玻璃培养管 | 康宁 | 07-250-125 | |
| 玻璃比色皿 | 科学策略 | G102 | |
| LabVIEW | 国家仪器 | 776671-35 | |
| SGE 气密型注射器，鲁尔锁扣 | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 深孔板 1.3 ml & 2.0 ml | 赛默飞世尔科技：Nunc | 278743 | |
| 封板膜 | 赛默飞世尔科技：Nunc | 276000 | |
| 台风 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 圆形滤纸 90 mm | Whatman | 1450-090 |
参考文献
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of i....
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