В пробирке мезотелиальной Анализ просвет, что модели ранних стадиях рака яичников Метастазы

Summary

Мезотелиальной анализ оформления, описанные здесь преимущества флуоресцентно меченых клеток и покадровой видео микроскопии для визуализации и количественного измерения взаимодействия рака яичников многоклеточных сфероидов и мезотелиальной монослоя клеток. Этот тест моделирует ранних стадиях метастазирования рака яичников.

Abstract

Рак яичников является пятой по значимости причиной смертности, связанной с раком, в Соединенных Штатах¹. Несмотря на положительный первоначальный ответ на терапию, у 70-90 процентов женщин с раком яичников развиваются новые метастазы, и рецидив часто приводит к летальному^{исходу.} Таким образом, необходимо понять, как возникают вторичные метастазы, чтобы разработать более эффективные методы лечения рака яичников на промежуточной и поздней стадии. Метастазирование рака яичников происходит, когда злокачественные клетки отделяются от первичного опухолевого очага и распространяются по всей брюшной полости. Диссеминированные клетки могут образовывать многоклеточные кластеры, или сфероиды, которые либо останутся неприкрепленными, либо имплантируются в органы в брюшной полости³ (Рисунок 1, Фильм 1).

Все органы в брюшной полости выстланы одним непрерывным слоем мезотелиальных клеток^4-6 (Рисунок 2). Тем не менее, мезотелиальные клетки отсутствуют в нижних опухолевых образованиях брюшины, что выявлено при электронном микрографическом исследовании участков^3,5-7 опухолевой ткани человека (рис. 2). Это говорит о том, что мезотелиальные клетки исключаются из-под опухолевой массы в результате неизвестного процесса.

Предыдущие эксперименты in vitro показали, что первичные раковые клетки яичников более эффективно прикрепляются к внеклеточному матриксу, чем к мезотелиальным клеткам8, а более поздние исследования показали, что первичные перитонеальные мезотелиальные клетки на самом деле обеспечивают барьер для адгезии и инвазии раковых клеток яичников (по сравнению с адгезией и инвазией на субстратах, которые не были покрыты мезотелиальными клетками)^9,10. Это говорит о том, что мезотелиальные клетки действуют как барьер против метастазирования рака яичников. Клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых клетки рака яичников прорывают этот барьер и исключают мезотелий, до недавнего времени оставались неизвестными.

Здесь мы описываем методологию анализа in vitro, которая моделирует взаимодействие между сфероидами клеток рака яичников и мезотелиальными клетками in vivo (Рисунок 3, Фильм 2). Наш протокол был адаптирован из ранее описанных методов анализа взаимодействий опухолевых клеток яичников с мезотелиальными монослоями^8-16 и впервые был описан в отчете, показывающем, что опухолевые клетки яичников используют интегрин-зависимую активацию миозина и силу вытяжения для содействия исключению мезотелиальных клеток из-под опухолевого сфероида¹⁷. Эта модель использует преимущества покадровой флуоресцентной микроскопии для мониторинга двух клеточных популяций в режиме реального времени, предоставляя пространственную и временную информацию о взаимодействии. Клетки рака яичников экспрессируют красный флуоресцентный белок (RFP), в то время как мезотелиальные клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP). RFP-экспрессирующие сфероиды раковых клеток яичников присоединяются к GFP-экспрессирующему мезотелиальному монослою. Сфероиды распространяются, вторгаются и вытесняют мезотелиальные клетки, создавая дыру в монослое. Это отверстие визуализируется в виде негативного пространства (черного) на изображении GFP. Затем можно измерить площадь отверстия для количественного анализа различий в активности клиренса между контрольной и экспериментальной популяциями рака яичников и/или мезотелиальных клеток. Для этого анализа требуется лишь небольшое количество клеток рака яичников (100 клеток на сфероид X 20-30 сфероидов на одно состояние), поэтому его можно провести с использованием ценных образцов клеток первичной опухоли. Кроме того, этот анализ может быть легко адаптирован для высокопроизводительного скрининга.

Protocol

1. Рак яичников Сотовые сфероид Формирование

1. RFP-экспрессирующие клетки рака яичников культивируют в 10% базы Средний (пользовательские культуральной среде ячейку, содержащую 50:50 смесь 199 и MCDB105, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пера стрептококк). Чтобы выразить ППП в немеченого клеток рака яичников, трансфекции клеток плазмиды, содержащей ППП и выбрать для клеток, экспрессирующих ППП. Кроме того, вирусные векторы могут быть использованы для временно выразить флуоресцентные белки, или клетки могут быть предварительно инкубируют с красным флуоресцентным красителем клетки трекер (Invitrogen).
2. До формирования сфероидо....

Discussion

"Анализ мезотелиальной просвет", представленные здесь используется замедленная микроскопии для наблюдения за взаимодействием рака яичников многоклеточных сфероидов и мезотелиальной монослоя клетки, в больших пространственных и временных деталей. Ранее несколько групп ^8-14 использовал конечной анализы, чтобы показать, что клетки рака яичников придают и вторгнуться в мезотелиальной монослоя клеток. Этот тест уникален тем, что он использует флуоресцентно меченых клеток отличить опухолевые клетки от мез.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
OVCA433 клеток рака яичников			Подарок от д-р Деннис Slamon
ZT мезотелиальные клетки			Подарок от доктора Тана Инс
Среды 199	Гибко	19950
MCDB105	Сотовые Приложения Инк	117-500
FBS-тепло инактивированная	Гибко	10082
Пен-Strep	Гибко	15070
96 пластин	Corning Costar	3799
Полигидроксиэтилметакрилат (поли-НЕМА)	Sigma Aldrich	192 066-25G	Для поли-НЕМА решение растворить 6 мг поли-НЕМА порошок в 1 мл 95% этанола
EtOH	Pharmco-aaper	111ACS200	Разбавить до 95% в дН 2 0
Капот клеточных культур	Nuaire	NU-425-300
Культуры ткани инкубатор	Thermo Scientific	3110
инкубатор для поли-НЕМА пластин	Labline инструменты	Императорский III 305
Настольная центрифуга	Heraeus	75003429/01
6 хорошо стеклянным дном блюдо	Маттек корп.	P06G-1.5-20-F
Фибронектин	Сигма	F1141-1 мг
PBS	CellGro	21-040-CV
Timelapse микроскоп:
Микроскоп	Nikon		Ti-E Перевернутый Моторизованный флуоресцентный покадровой микроскоп со встроенным совершенная система фокусировки
Объектив	Nikon		20X-0.75 численного apeture
Галогенные трансиллюминатор	Nikon		0,52 NA долго конденсатора рабочее расстояние
Возбуждение и излучение фильтры	Chroma одного фильтры проходят в Nikon жилья		GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
Передаются и Epifluoresce пути света	Саттер		Умные жалюзи
Линейный кодировке моторизованных этапе	Nikon
Охлаждение с зарядовой связью камеры устройства	Hamamatsu	ORCA-AG
Микроскоп инкубации камеру с температурой и CO 2, контроль	изготовленный на заказ
Таблица Виброизоляция	TMC
NIS-Elements программное обеспечение	Nikon		Версия 3