Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen denir Escherichia coli.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Fenotipleri fiziksel (protein-protein gibi) ve fonksiyonel (örneğin, gen-geni ya da gen) etkileşimleri (GI) 1 karmaşık bir dizi ile belirlenmiştir. Fiziksel etkileşim bakteriyel protein kompleksleri olarak ilişkili oldukları işaret olsa da, onlar mutlaka yolunun düzey fonksiyonel relationships1 açıklamayız. İki silinmiş veya inaktif genleri taşıyan çift mutantların büyüme ölçülür ve karşılık gelen tek mutantlar ile karşılaştırıldığında hangi GI ekranlar, lokusları arasında epistatik bağımlılıkları aydınlatmak ve dolayısıyla yeni fonksiyonel ilişkiler 2 sorgulamak ve keşfetmek için bir araç sağlayabilir. Büyük ölçekli GI haritaları maya 3-7 gibi ökaryotik organizmalar için bildirilen, ancak GI bilgi bakteriyel genomlar işlevsel açıklama engellemektedir prokaryotlar 8 için seyrek kalır edilmiştir. Bu amaçla, ve diğerleri, yüksek verim kantitatif bakteri GI tarama yöntemleri, 9, 10 geliştirdik Burada, kantitatif E. gerçekleştirmek için gereken önemli adımları sunmak sistemik oluşturmak ve bir koloni dizisi biçiminde çift mutantlar çok sayıda spor ölçmek için doğal bakteriyel konjugasyon ve homolog rekombinasyon kullanarak coli bir genom-ölçekli 9 Sentetik Genetik Array (eSGA) tarama prosedürü,. Kısaca, bir robot aktarmak için kullanılır , konjugasyon yoluyla, kloramfenikol (Cm) - İşaretli F-alıcı suşlar - mühendislik Hfr gelen mutant alleli (rekombinasyon Yüksek frekans) kanamisin sıralı bir dizi (Kan) içine 'donör suşları' olarak işaretlenmiş. Genellikle, biz kayıp fonksiyon-gerekli olmayan gen delesyonlar taşıyan tek mutantlar ('Keio' koleksiyonu 11 gibi) ve temel gen mutasyonları hypomorphic (azaltılmış protein ekspresyonu, istikrar, ya da etkinlik 9, 12, 13 görüşmekte yani allelleri) kullanın non-esansiyel ve esansiyel genler, res fonksiyonel dernekleri sorgulamakpectively. Homolog yeniden birleşme ve bunu takip eden genetik değiş tokuş aracılı sonra, elde edilen çift mutant hem de antibiyotik içeren katı ortam üzerinde seçilir. Akıbet sonra, plakaları dijital görüntülü ve koloni boyutları nicel bir in-house otomatik görüntü işleme sistemi 14 kullanılarak puanlanır. Yaktığımız bir çift mutant büyüme oranı beklenen 9 daha da belirgin olarak daha iyi veya daha kötü olduğu zaman ortaya çıkar. Ağırlaştırıcı (veya negatif) yaktığımız çoğu aynı temel süreç 2 çarpacak telafi yollarının gelen genlerin çiftleri kaybı fonksiyon-mutasyonlar arasındaki sonuçlanabilir. Burada, tek bir gen kaybı ya da tek bir mutasyona uğramış uygun bir şekilde, arabelleğe. Ancak, her iki yollarının kaybı zararlı olduğunu ve sentetik öldürücülüğü veya hastalık (yani yavaş büyüme) ile sonuçlanır. Tersine, hafifletilmesi (veya pozitif) etkileşimleri aynı yolu ya da karmaşık protein 2 genleri arasında meydana gelebilecektek başına ya da gen silinmesi sık sık yoldan veya daha fazla ilave pertürbasyonlar, böylece büyüme aktivitesini azaltır, ve olmayan bu tür karmaşık ve normal fonksiyonunu karıştırmayı için yeterlidir. Genel olarak, sistematik olarak tanımlanması ve GI ağları analiz diğer yaklaşımlar tarafından cevapsız yolağı düzeyde bilgi 9 varılabilir hangi genlerin, çok sayıda arasındaki fonksiyonel ilişkilerin tarafsız, global haritalar sağlayabilir.
Protokol
1. Recombineering 15, 16 tarafından Hfr Cavalli Donör Mutant soylar oluşturma
ESGA verici lekeler oluşturmak için adımlar aşağıda tarif edilmektedir. Kısaca, biz hedef λ kullanın - Kırmızı elzem olmayan gen delesyon mutantlar (bölüm 1.1) veya daha sonra olarak kullanılan elzem geni hypomorphic mutant suşlar donör (bölüm 1.2) oluşturmak için PCR tarafından oluşturulan amplifiye seçilebilir DNA işaretleyicisi kaset homolog rekombinasyon 16 parçaladı aracılı GI ağları tanımlamak için 'sorgular'.
Not: teknoloji geliştirme sürecinde, iyi tanımlanmış ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
GI'lar, genler arasındaki fonksiyonel ilişkileri ortaya çıkarır. Benzer şekilde, aynı yolaktaki genler benzer GI örüntüleri sergilediği ve GI profil benzerliği fenotiplerin uyumluluğunu temsil ettiği için, GI profillerini kümeleyerek fonksiyonel olarak ilişkili genleri yolaklara gruplandırabiliriz. GI ve GI korelasyon ağlarının fiziksel etkileşim bilgileriyle veya genomik bağlam (GC) ilişkileri gibi diğer ilişkilendirme verileriyle entegrasyonu, bakterilerdeki temel biyolojik sistemleri (ve sistemler arası etkileşimi) ta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz GI sorgulayarak bir patika düzeyde bakteriyel gen fonksiyonlarını araştırmak için robotik eSGA tarama kullanmak için adım adım protokol ana hatlarıyla. Bu yaklaşım, E. tek tek genler hem de tüm biyolojik sistemlerde incelemek için kullanılabilir coli. Dikkatle tüm uygun kontroller dahil olmak üzere yukarıda anlatılan deneysel adımlar, yürütme ve titizlikle analiz ve bağımsız GI veri fonksiyonel yeni keşifler yapma eSGA başarısı için önemli yönleri vardır doğrulayarak. ESGA, E. GI çalışmak .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu eser Genom Kanada, Ontario Genomik Enstitüsü ve JG ve AE AG Sağlık Araştırma hibe Kanada Enstitüsü'nün fonları tarafından desteklenmiştir Vanier Kanada Lisansüstü Bursu bir alıcı olduğunu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| I. Antibiyotikler | |||
| Kloramfenikol | Biyomarket | #CLR201 | |
| Kanamisin | #KAN201 | ||
| Ampisilin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani besiyeri | |||
| LB tozu | Biyomarket | #LBL405 | |
| Agar | Biyomarket | #AGR003 | |
| 3. Bakteriyel Suşlar ve Plazmidler | |||
| Hfr Cavalli suşu λkırmızı sistem (JL238) | Babu ve ark.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetik Stok Merkezi, Yale | ||
| Keio E. coli F- alıcı koleksiyonu | Japonya Ulusal BiyoKaynak Projesi (National BioResource Project - NBRP)11 | ||
| Hipomorfik E. coli F- SPA-etiketli suşlar | Açık biyosistemler; Babu ve ark.14 | ||
| 4. Primerlar | |||
| pKD3 tabanlı tuzsuz sabit primerler | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' | ||
| Tuzdan arındırılmış özel primerler | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' | ||
| Tuzdan arındırılmış özel primerler | F2 ve R2: pKD3 dizisine dayalı 20 nt sabit bölgeler ve 45 nt özel homoloji bölgeleri F2 sabit bölgesi: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'' R2 sabit bölgesi: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' S1 ve S2: SPA-Cm kasetinin amplifikasyonu için primerleme amacıyla kullanılan 27 nt'lik sabit bölgeler ve 45 nt'lik özel homoloji bölgeleri S1 sabit bölgesi: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'' S2 sabit bölgesi: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'' KOCO-F ve KOCO-C: Esansiyel olmayan gen delesyon bölgesinden veya esansiyel genden 200 bp uzaklıkta olan 20 nt primerler gen SPA-etiketi ekleme bölgesi | ||
| 5. PCR ve Elektroforez Reaktifleri | |||
| Taq DNA polimeraz | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR tamponu | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTP'ler | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl22 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agaroz | Biyomarket | # AGA002 | |
| Yükleme boyası | NEB | #B7021S | |
| Etidyum bromür | Biyomarket | # ETB444 | |
| 10X TBE tamponu | Biyomarket | # ETB444.10 | |
| Tris Bazı | Biyomarket | # TRS001 | |
| Borik asit | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA merdiveni | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA İzolasyon ve Saflaştırma Kitleri | |||
| Genomik DNA izolasyon ve saflaştırma kiti | Promega | #A1120 | |
| Plazmid Midi kiti | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR saflaştırma kiti | Qiagen | #28104 | |
| 7. PCR, Transformasyon ve Replika-pinleme için Ekipmanlar | |||
| Termal döngüleyici | BioRad, iCycler | ||
| Agaroz jel elektroforezi | BioRad | ||
| Elektroporatör | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0,2 cm elektroporasyon küveti | Bio-Rad | ||
| 42 °C su banyolu çalkalayıcı | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 santrifüj | Beckman Coulter | ||
| 32 °Çalkalayıcı | New Brunswick Scientific, ABD | ||
| 32 °C plaka inkübatörü | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA masaüstü robotu | Singer Instruments | ||
| 96, 384 ve 1.536 pin yoğunluklu padler | Singer Instruments | ||
| 96 veya 384 adet uzun pin | Singer Instruments | ||
| 8. Görüntüleme Ekipmanları | |||
| Kamera standı | Kaiser | ||
| Dijital kamera, 10 megapiksel | Herhangi Bir Tedarikçi | ||
| Işıklı kutular, Testrite 16" x 24" birimler | Testrite | ||
| 9. Pedlerin veya Plakaların Geri Dönüşümü | |||
| %10'luk çamaşır suyu | Herhangi bir Tedarikçi | ||
| %70 etanol | Herhangi bir Tedarikçi | ||
| Steril distile su | Herhangi bir Tedarikçi | ||
| Laminer akış kabini | Herhangi bir Tedarikçi | ||
| Ultraviyole lamba | Herhangi Bir Tedarikçi | ||
| 10. Laboratuvar Gereçleri | |||
| 50 ml polipropilen tüpler | Herhangi Bir Tedarikçi | ||
| 1,5 ml mikro santrifüj tüpleri | Herhangi Bir Tedarikçi | ||
| 250 ml erlenmayerleri | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml steril kültür tüpleri | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Kriyojenik tüpler | VWR | # 479-3221 | |
| Dikdörtgen Plakalar | Singer Instruments | ||
| 96 kuyucuklu ve 384 kuyucuklu mikrotitre plakaları | Singer Instruments | Nunc | |
| Çok kuyucuklu plakaların mühürlenmesi için plaka silindiri | Sigma | #R1275 | |
| plakalar | ABgene | # AB-0580 | |
| Yapışkan plaka sızdırmazlık şeritleri | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C dondurucusu | Herhangi Bir Tedarikçi |
Kaynaklar
- Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).
- Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
