השרשה ותוך גולגולת Stereotactic<em&gt; בחי</em&gt; הדמית bioluminescent של xenografts גידול במערכת מודל עכבר של multiforme glioblastoma

סיכום

אנו מתארים שיטה משולבת להשתלה המדויקת, stereotactic של תאי multiforme glioblastoma אדם לתוך המוח של עכברים בעירום וסידורי עוקבים In vivo הדמיה כדי לפקח צמיחה ותגובה לטיפול בxenografts התוצאה.

תקציר

multiforme glioblastoma (GBM) הוא סרטן מוח ראשוני בדרגה גבוהה עם הישרדות חציונית של 14.6 חודשים בלבד בבני אדם, למרות טיפול, שיטה תלת סטנדרטי המורכב של כריתה כירורגית, הקרנות לאחר הניתוח וכימותרפיה temozolomide ^1. גישות טיפוליות חדשות באופן ברור יש צורך לשפר את ההישרדות ואת איכות חיי מטופל. הפיתוח של אסטרטגיות טיפול יעילות יותר יהיה בעזרת מודלים של בעלי חי GBM כי לסכם מחלה אנושית עדיין לאפשר הדמיה סידורית כדי לפקח על גדילת גידול ותגובה לטיפול. במאמר זה, אנו מתארים הטכניקה שלנו להשתלת stereotactic המדויקת של תאי סרטן GBM יו imageable לתוך מוחם של עכברים בעירום וכתוצאה מxenografts גידול שלסכם מאפיינים קליניים עיקריים של GBM ^2. שיטה זו מניבה גידולים לשעתק וממוקמות במקומות אנטומיים מדויקים תוך מתן בתחום הדמית vivo bioluminescent סדרתי כדי לפקח על תוךצמיחת גולגולת xenograft ותגובה לטיפולים ^3-5. שיטה זו גם נסבלת היטב על ידי בעלי החיים בעלי תחלואת perioperative נמוך ותמותה.

פרוטוקול

הכנת תאים סרטניים לפני ניתוח א

1. U251 תאי multiforme glioblastoma transduce עם וקטור ביטוי lentiviral (pGreenFire, המערכה Biosciences) ליציבות להביע את גן בלוציפראז הגחלילית.
2. תאים אלה גודלו ב10 מ"ל של השינוי של מלא Dulbecco של המדיום של הנשר (DMEM), אשר מורכב מDMEM בתוספת סרום 10% עובריים עגל, 1% פניצילין סטרפטומיצין, וחומצות אמינו לא חיוניות 1% בבקבוקון תרבית רקמת T75 דוגר ב 5% C0 ₂ ו 37 ° C.
3. לבצע תרבית תאים סטנדרטית, החל בשטיפת התאים עם פוספט נאגר מלוח (PBS) ואחרי trypsinizing.
4. להרוות טריפסין עם DMEM מלא, להעביר את הפתרון לבקבוק 50 מיליליטר חרוטים ולקבוע את הריכוז הסלולרי באמצעות מונה קולטר.
5. צנטריפוגה את התאים שנקטפו בDMEM מלא ל 3 דקות בקצב של כ 3000 סיבובים לדקה.
6. לאחר צנטריפוגה, לשאוב שלf התקשורת משאירה רק גלולה של תאים בחלק התחתון של בקבוק 50 מיליליטר החרוטים.
7. עובד במהירות כדי למנוע את התאים מפני התייבשות, מחדש להשעות את התאים בנפח הטרי DMEM המלא כדי להשיג את הריכוז הרצוי של 50,000 תאים / μl והעברה לבקבוקון סטרילי 2 מ"ל מונח על קרח.
8. תאים על קרח צריכים להיות vortexed בקצרה על הגדרה נמוכה מדי ~ 20 דקות כדי למנוע הידבקות תא. תאים ניתן להשתמש בבטחה לimplantations תוך גולגולתי עד שעות לאחר הצבה על קרח.

השרשת xenograft orthotopic B.

1. שוקל athymic NCR עכבר עירום (נו / נו) להקים בסיס משקל, לפני השתלה. בדרך כלל אנחנו בוחרים עכברים 6-10 שבועות של גיל עם משקולות בין 17 ו 24 גרם.
2. 1 שעה לפני ההשתלה, מראש תרופות משככות כאבים לעכבר עם 5 מ"ג / ק"ג של סם meloxicam אינו הסטרואידים אנטי הדלקתי באמצעות הזרקה תת עורית לטיפול בכאב שלאחר הניתוח ודלקת.
3. Anesthetizדואר החיה עם זריקת intraperitoneal מתערובת קטמין / xylazine במינון של 140 מ"ג / ק"ג ו 10 מ"ג / קילו בהתאמה.
4. ודא שהעכבר הוא די הרדים ידי הערכת התגובה הספונטנית של בעל החיים לקמצוץ בוהן. אם בעל החיים מגיבים לקמצוץ בוהן, לעכב את ההליך עד להרדמה תיכנס לתוקף או לשקול הזרקת הרדמה נוספת (<25% מהסכום המקורי).
5. הכן את העכבר מורדם למיצוב בStoelting הדיגיטלי רק לפלטפורמת Stereotactic מאוס (Stoelting Inc) על ידי משדל את השיניים החותכות של העכבר בשורת העקיצה עוצר החוטם והידוק מהדק האף מעל החוטם תוך ההבטחה כי ראשו של העכבר הוא על מטוס ברמה.
6. העבר את העכבר המאופק לפלטפורמת stereotactic Stoelting, התאמת המיצוב של בעלי החיים, כך שקצות פסי אוזניו בסוף הזנב של תעלת האוזן. ברגע שמיצוב גולגולת לזנבו של בעל החיים כבר adjusטד, לאבטח את סרגל הביס למסגרת stereotactic. העכבר צריך להיות מונח על צלחת חברת פלסטיק חימום (הרווארד Apparatus) מאובטחת עם קלטת לפלטפורמת Stoelting לספק משוב ויסות טמפרטורה מבוקרת במהלך הניתוח.
7. התאם את הגובה של סורגי אוזן כנדרשת ולאחר מכן לקדם את סורגי האוזן לחלק הזנב של תעלת האוזן, אבטחתן כך שראשו של העכבר הוא במישור אופקי ומשותק במגע אצבע. לעקוב בזהירות לסימנים של מצוקה נשימתית לאחר השמה של סורגי האוזן. שחרר ומחדש את העמדה שאם בעל החיים במצוקה.
8. הכנס את הקצה המשומן של בדיקת חום בפי טבעת המחוברת לבקר טמפרטורת TCAT-2DF (Apparatus הרווארד) לניטור הטמפרטורה של בעל החיים ולספק בקרת משוב לצלחת החימום ממוקמת מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ב 36 מעלות צלזיוס במהלך ההליך.
9. החל משחת עיניים לעיניים לprevent ייבוש.
10. החל תמיסת פולידין לחלק העליון של ראשו של העכבר כדי לחטא את אתר החתך, מקפיד שלא לגעת בעיניים.
11. בצע קמצוץ בוהן כדי לאשר את העכבר הוא מחוסר הכרה, ומספק כמות קטנה של קטמין הנוסף / xylazine (<25% מהמינון הראשוני) במידת צורך.
12. לנקות קצת 0.45 מ"מ Burr התרגיל (Stoelting) שצורף לתרגיל (Foredom Microdrill) באמצעות כרית אלכוהול ולאחר מכן לחטא את המקדח בחרוז זכוכית מעקר (Germinator 500, CellPoint מדעי) עבור 15 שניות, לטבול רק את המקדח לתוך חרוזי המעקר.
13. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך סנטימטר 0.75 longitudinally באמצע הקרקפת משתרעת מהרמה של עיני caudally. אשר להדמיה של גבחת.
14. הצרף מחזיק מקדחה לפלטפורמת Stoelting ולמקם את מקדחה (Foredom Microdrill) עם קצת 0.45 מ"מ Burr תרגיל (Stoelting) במחזיק המקדחה, לקבע אותו בתפקיד.
15. הנח את המקדח בדיוק מעל tהוא גבחת ולאחר מכן אפס מתוך x, y, z קואורדינטות של תצוגת stereotactic הדיגיטלית. העבר את קצה המקדח לעמדה אחורי 2 מ"מ ורוחב 1.5 מ"מ לגבחת באונה הימנית במוח ולקדוח לתוך הגולגולת של החיה עם מקדחת Foredom, מנקב רק העצם. צמר גפן סטרילי ניתן להשתמש בעדינות לחזור בו את הקצוות של החתך כדי להקל הדמיה של הגולגולת.
16. הסר את התרגיל והתרגיל מבעל פלטפורמת stereotactic.
17. צרף משאבת מזרק מזרק Nanomite (Apparatus הרווארד) לפלטפורמת stereotactic.
18. מסיר את התאים מקרח וגם עדינות מערבולת הבקבוקון המכיל את התאים הסרטניים עם פולסים קצרים או בעדינות קפיצית הבקבוקון מחדש להשעות את התאים. צייר את 7 μl של השעית התא דרך 30 מד "מחט 1 ארוכה שטוחה פוע מחוברת למזרק 10 μl (המילטון מזרק). הימנע מבועות אוויר גדולות במזרק. ודא כי אין בועות אוויר ב6 μl הראשוני של נוזל WHich יהיה הנפח הכולל הוזרק לעכברים. בועות אוויר קטנות בμl 1 הנותרים הן לא עניין. הימנע קופצים לצייר חוזר ונשנה של השעית התא אם אפשר כדי למזער את הניזק לתאים.
19. מקם את המזרק הטעון לתוך מזרק המזרק. שימוש בכרית אלכוהול, והסרת חלק מנוזל השעית התא שמופיע בקצה המחט על מנת למנוע זיהום של אתר החתך עם תאים סרטניים שעלולות לגרום לגידול ההולך וגובר במרחב extracranial.
20. הגדר את משאבת ההזרקה, כדי לספק 6.0 μl בשיעור של 0.5 μl / דקה. Μl 1 מתוך השעית תא שנותרה במזרק לאחר ההשתלה מבטיחה כי בועות האוויר שלעתים קרובות אוספות במזרק לא מזריקות לבעלי החיים. הזרקה של בועות אוויר עלולה לגרום לתסחיף אוויר קטלני.
21. לקדם את מחט המזרק לתוך חור Burr שמירה ניצבת מחט (90 מעלות) לגולגולת. ברגע שהמחט חצתה את הגולגולת, אפס coordinאטס על הצג הדיגיטלי ואז להתקדם לאט stereotactic קצה המחט על פני תקופה של 4 דקות עד שהוא מגיע לעומק של 2.5 מ"מ. המחט עוברת דרך הקליפה וחלקים של ההיפוקמפוס האחורי. X, y, z קואורדינטות להשתלת stereotactic נבחרו לייצר גידול בעמדה רוחבית באונה המוחית תוך הימנעות פגיעה במבני מוח קריטיים כגון התלמוס וקרבה לחדרי לב ובכך מקטינים את הסיכוי לזריעת הנוזל השדרתי עם תאים סרטניים שעלול לגרום לגידולים בעמוד שדרה לא רצויים. מיקום יחסי לגבחת אחורי נבחר כדי להפחית את הסיכוי לגידול גדול, מתקדם מקומי ulcerating למסלול. השהה עם המחט בעומק של 2 דקות ולאחר מכן ליזום השתלה של תאים.
22. במהלך השתלה, לייבש את הגולגולת שוב ושוב עם חנית ספוג מייקרו כדי להסיר כל נוזל גידול המכיל שאולי refluxed מתוך חור הצרימה, במהלךהשתלה. למנוע שיבוש המחט עם ספוג מייקרו. הסרת נוזל זה אמורה להפחית את הסיכוי לגידול ההולך וגובר במרחב extracranial.
23. לאחר ההזרקה היא מוחלטת, להשאיר את המחט במוח לכ 2 דקות ולאחר מכן למשוך את המחט באיטיות על פני תקופה של 3-4 דקות.
24. שחרר את ברי אוזניים ועוצרות את החוטם ולהסיר את העכבר ממנגנון stereotactic.
25. סגור את חור הקוץ בגולגולת בשעוות עצם סטרילי הופקד על ידי שפשוף שעווה הלוך ושוב מעל לבור שBurr מקצה העץ של מוליך סטרילי כותנה שקצו. המשך להפעיל שעוות עצם, עד שהבור אטום לחלוטין ושעוות עצם איטום חור קלף היא סומק עם הגולגולת הסמוכה.
26. Re-מקורבי שולי החתך עם מטליות כותנה סטריליים והחלים דבק רקמות וטרינרית כדי לאטום את הפצע, מקפיד להימנע מחשיפת העיניים לדבק של בעלי החיים.
27. לבסוף, הנח את העכבר על משטח חימום המוגדר 37 מעלותC עד שהחיה משחזר את הכרתו. להעביר את בעלי החיים בחזרה לכלוב המקורי שלו פעם אחת על העכבר הוא ערני ומגיב.

ג bioluminescent הדמיה (BLI) כדי לפקח על גדילה ותגובה לטיפול גידול

הוראות קצרות פעלו להדמית bioluminescent.

1. הרדם עכברים מושתלים בעבר עם גידול בחדר עם 2% isoflurane וחמצן.
2. בעוד העכברים מורדמים, מזריק אותם מתחת לעור או או intraperitoneally עם 60 μl של מלח אשלגן D-luciferin המדולל ב PBS לריכוז של 50 מ"ג / מ"ל.
3. הפעל את זרימת ההרדמה אל אצטרובלי האף בסורק הדמית bioluminescent ולהעביר את העכברים במהירות לסורק הצבת חוטמיהם בגביעי האף.
4. מקם חוצצים שחורים בין העכברים להגביל את הדימום של אות bioluminescent מגידול בעוצמת אות גבוהה לגידול צמוד עם אות נמוכה בהרבה.
5. שימושתוכנת תמונת החיים, לקחת חשיפות סידוריות תכופות למשך תקופה כוללת של עד 30 דקות לאחר הזמן של הזרקה של D-luciferin. אנו בעד קביעת זמן החשיפה ל" אוטומטי "כדי להגביל את הסבירות לתמונה מתחת או חשופת יתר. לא חשיפה יחידה צריכה להיות> 5 דקות.
6. בצע לחזור הדמית bioluminescent במרווחי הזמן מתאימים. הדמיה שבועית סידורית היא אפשרות סבירה לניסויים אורכיים רבים בדיקות לתגובה לטיפול.
7. לאחר רכישה של תמונות, השתמש בתוכנת תמונת חיים לנתח גידולים על ידי ציור אזור של עניין (ROI) מסביב לכל גידול בכל תמונה שנרכשה במהלך פגישת הדמית bioluminescent. החל אזור שני, קטן יותר של ריבית לאגף התחתון של כל עכבר בכל תמונה כרקע של אזור עניין כדי לתקן את אות bioluminescent של גידול המבוססת על המידה של עוצמת אות רקע bioluminescent. אנחנו מעדיפים להשתמש בהגדרה "הזיו" ולא "ספירות" כפלטערכים עבור אות bioluminescent.
8. לייצא את תוצאות ההחזר על ההשקעה לתוך Excel ולקבוע את אות bioluminescent רקע המותאמת המרבית לכל עכבר.
9. חזור על הדמית bioluminescent כפי שצוין לניטור סדרה של גידול. בניסויים שלנו, אנו מבצעים BLI השבועי. אנחנו מעדיפים קביעת האות המקסימלי BLI לישיבת הדמיה ניתנה על ידי לקיחת חשיפות תכופות מעל 5-30 דקות לאחר הזרקה של D-luciferin.

תוצאות מייצגות ד

טכניקת השתלת stereotactic זה קשור לשיעור גידול מוצלח קח של 90-100% ועם תמותת perioperative נמוכה שהיא בדרך כלל פחות מ 5%. הסיכון לתופעות לוואי בלתי צפויות הוא נמוך גם עם טכניקה זו, כולל סיבוכים כגון זריעה של חוט השדרה מתאי גידול מושתל לחדרי לב, או צמיחת גידול extracranial משתי הזריעה של החתך עם תאים סרטניים או סגירה לקויה של חור Burrllowing גידול תוך גולגולתי להרחיב דרך הפתח בגולגולת.

ניתוח vivo לשעבר של xenografts גידול הפגין אזורים צפויים של היפוקסיה, ביטוי VEGF מוגבר, ונימק. מיקרוסקופיה פלורסנט לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הביע ביציבות על ידי שורת תאי GBM גילתה אופי infiltrative של xenografts אלה.

איור 1 מציג את התוצאות של השתלה מוצלחת stereotactic טיפוסית של תאי GBM במוח של עכבר. זו בדיקת MRI מוח T2 משוקללת של מוח עכבר הופיע עם מגנט 9.4 טסלה 21 ימים לאחר השתלה בטכניקה שתוארה כאן. איור 1 מגלה מוקד בודד של גידול באונה הימנית (צוף בורוד) מדידת 19 מ"מ ³ שlocalizes לקואורדינטות המדויקות של אתר ההשתלה.

איור 2 מציג את התוצאות של הדמית bioluminescent באמצעות techn iques מתואר כאן לקבוצה של 10 עכברים עם גידולים מושתלים stereotactically שהיו שווה מרובדת מבוססת על עוצמת אות bioluminescent מרבית לקבל גם הקרנת גולגולת (4 x 4 שברים יומיים GY) או ללא טיפול כלל. בניסוי זה, bioluminescent ההדמיה מראה כי הקרנות מעכבות את שגשוגם של גידולים המושתלים, וכתוצאה מכך אין עלייה באות bioluminescent המזוהה, ואילו את האות לעלייה ניכרת בגידולי שליטה מדומה מוקרנים, עקב התפשטות בלתי מבוקרת של התאים הסרטניים.

איור 1 (וידאו). סעיפי MRI עטרה של מוח עכבר המכיל גידול multiforme glioblastoma U251 עם contouring של נפח הגידול (בצבע ורוד). הסריקה בוצעה באמצעות פרוטוקול משוקלל T2 ספין הד בסורק 9.4 טסלה. לחץ כאן לצפייה בסרט.

מחדש 2 "src =" / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg "/>
איור 2. 10 עכברים עם גידולי multiforme glioblastoma מושתלים stereotactically טופלו גם עם טיפול חיצוני אלומת קרינה עד 16 Gy ב 4 שברים או ללא טיפול. עכברים צלמו עם הדמית bioluminescent לפני הטיפול ושבוע לאחר תחילת הטיפול. הגרף מציג פליטת אור יחסית מחושבת כשינוי קיפול החציוני בו שינוי הקיפול מוגדר כיחס שווי BLI מקסימאלי נוכחי לשווי מקסימאלי BLI טיפול מראש.

דיון

השיטה של השתלת stereotactic של תאים סרטניים בעכברים המתוארים במאמר זה reproducibly מייצרת גידולים, אשר סביר לסכם דפוס infiltrative ומהיר צמיחה של גליובלסטומה multiforme הקלינית ^{2, 6-8.} טכניקה זו במיוחד היטב מתאימה לניסויי stratifying עכברים באופן שווה לקבוצות טיפול שונות בי גידולים לשעתק גודל דומה ומאפיינים ביולוגיים ובמקומות אנטומיים ספציפיים רצויים. השתלת Stereotactic של תאים סרטניים תוך שימוש בטכניקות שאנו מתארים אמורה להיות בקלות להשגה על ידי מעבדות מחקר translation...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תיאור	ספק	מספר קטלוגים	תגובות
רק למכשירים דיגיטליים Stereotaxic מאוסים	Stoelting	51730D	פלטפורמת Stereotactic להשתלת עכבר
קטמין / xylazine			הרדמה בזריקות
משחת וטרינר Puralube (עיניים)	Amazon.com		כדי למנוע התייבשות של העיניים של העכבר
בעל לקדוח עבור פלטפורמת stereotactic	Stoelting	51681
מקדחה חשמלית micromotor	Stoelting	51449	לקידוח דרך הגולגולת
מקדח .45 מ"מ קרביד	Stoelting	514551
ספוגיות כותנה סטריליים	הפישר סיינטיפיק	23-400-100
חרוז זכוכית יבשה מעקר (Germinator 500)	בריינטרי מדעי	GER-5287	לעקר מכשירים כירורגיים מתכת
עכבר רקטלית בדיקה	בריינטרי מדעי	RET-3-ISO	תואם עם בקר הטמפרטורה
בקר טמפרטורה (TCAT-2DF)	הרווארד Apparatus	727561	בקר טמפרטורה כדי לשמור על הטמפרטורה של בעל החיים במהלך הניתוח
צלחת חימום קטנה	הרווארד Apparatus	727617	לשימוש עם בקר הטמפרטורה לחמם עכבר במהלך ניתוח. צלחת החימום מתאים שמתחת לעכבר על פלטפורמת stereotaxic.
אזמלים פנויים	BD-ארד פרקר	2015-11	# 10 אזמל
10 מזרק microliter	המילטון	7635-01	להזרקה של תאים סרטניים
30 מחטי מד, 1 "ארוכות, עם נקודה שטוחה	המילטון	שונה	חייב להיות תואם עם מזרק μl 10
Nanomite משאבת מזרק לתכנות	הרווארד Apparatus	704507	דיגיטלי ממונע מזרק מזרק למכשיר stereotaxic
ספוגי חניתות כירורגיות סטריליות תאית	Ultracell	40410	כדי לייבש את שדה הניתוח
שעוות עצם	Ethicon	W31	כדי לאטום את חור Burr
Tissumend השני דבק רקמות נספג סינטטי	מוצרי מעבדות וטרינרית	3002931	כדי לאטום את החתך
משאבת מים חמה עם כרית החימום	Gaymar	TP-650	עכברים מחמם בתקופה שלאחר הניתוח
IVIS ומינה השנייה	Caliper מדעי חיים		Bioluminescent imager
מלח אשלגן D-luciferin	ביוטכנולוגיה זהב	LUCK-1	Luciferin לbioluminescent הדמיה