시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를 quantifies C. elegans, 시냅스 수백이 빠르게 Z-평면 투영에 의해 도입 왜곡없이 하나의 샘플 내에서 특성화 수 있도록.
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이 논문에서
요약
초록
시냅스 강도는 presynaptic 신경 전달 물질 릴리스 행사 postsynaptic 응답의 진폭을 참조하고, 전반적인 신경 회로의 기능에 큰 영향을 미치고 있습니다. 시냅스 강도가 매우 postsynaptic 멤브레인에서 시냅스 사이트에서 클러스터된 신경 전달 물질 수용체의 풍부에 따라 달라집니다. 수용체 레벨이 발달 설립되며, 시냅스 소성 및 neuromodulation의 중요한 메커니즘을 나타내는 표면화된, subsynaptic, 그리고 세포 내 수영장, 사이 수용체 인신 매매에 의해 변경될 수 있습니다. synaptically-화된 신경 전달 물질 수용체 풍요로움을 계량하기위한 엄격한 방법은 시냅스 개발 및 소성을 공부하는 것이 필수적입니다. 그것이 아닌 시냅스 수영장에서 시냅스 구별, 그리고 시냅스의 다른 유형에 지역화된 수용체 인구들 사이에서 차별, 공간 정보를 유지하기 때문에 형광 현미경은 최적의 접근 방식이다. 유전자 모델 생물 Caenorhabditis elegan의은 특히 손상 동물의 네이티브 시냅스의 시험을 수 있도록 작은 크기와 상대의 신경 계통의 단순화, 투명성, 그리고 강력한 유전자 기술의 가용성으로 인해 이러한 연구에 가장 적합합니다.
여기에서 우리는 C.에 fluorescently-라벨이 시냅스 신경 전달 물질 수용체를 quantifying위한 방법을 제시 elegans. 그 주요 기능은 멀티 비행기 공촛점 현미경 출력 파일, tabulating 위치, 볼륨, 형광 강도 및 각 시냅스에 대한 전체 형광 세 차원에서 개별 시냅스의 자동 식별 및 분석입니다. 이 접근법은 공촛점 데이터의 Z-비행기 예측의 수동 분석을 두번 주요 장점이 있습니다. 공촛점 데이터 집합의 모든 비행기가 포함되어 있기 때문에 첫째, 어떤 데이터는 일반적으로 화소 농도의 평균이나 맥시멈을 토대로 Z-평면 투영을 통해 손실되지 않습니다. 시냅스의 둘째, 신분증은 자동이지만, 예전에 의해 검사를 수시냅스 다수의 데이터를 신속하고 정확하게 추출 수 있도록 데이터 분석 진행 등 perimenter. 샘플 당 시냅스 수천 수백 쉽게 큰 데이터를 생산하는 통계 능력을 극대화할 수 설정, 얻을 수있다. C를 준비하기위한 고려 사항 분석 및 치료 그룹 내에서 동물 간의 다양성을 최소화하기 위해 공촛점 이미징을 수행하기위한 elegans도 설명합니다. C를 분석하기 위해 개발된 있지만 elegans postsynaptic 수용체가이 방법은 실제로 synaptically-화된 단백질, 또는 개별 클러스터, puncta 또는 organelles에 현지되는 형광 신호의 모든 유형에 대해 일반적으로 유용합니다.
절차는 세 단계로 수행됩니다 : 1) 표본 2의 준비)를 공촛점 이미징, 그리고 3) 이미지 분석. 단계 1과 2는 C.에만 해당 elegans, 3 단계는 일반적으로 공촛점 micrographs에 작은 반점이있는 형광 신호에 적용할 수있는 동안.
프로토콜
1. 이미징에 대한 웜의 작성
프로토콜의이 세그먼트는 게시 C. 기반으로 elegans 문화 기술 1,2, 그리고이 그림 1에 설명되어있다.
- NA22 E. 높은 펩톤 NGM 한천 플레이트 (10 ㎝) 씨앗에 벌레를 성장 대장균 박테리아는 거의 굶어까지. immunostaining 경우, 한 접시가 안정적으로 길을 따라 계정 손실을 고려하고, 영상에 대한 웜 (파트 2 참조)을 선택하는 데 사용되는 엄격한 기준, 얼룩 한 개인에 대한 충분한 벌레를 생산합니다.
- 접시에 ddH 2 0 몇 ML를 따르고 의한 수확 웜, 간략하게 소용돌이 치는, 그리고 15 ML 원뿔 튜브 (반복 튜브에 벌레의 대부분을 전송하기 위해 필요한 경우)에 액체를 붓는. 3 분, 1000x g 대한 임상 원심의 펠릿. 뜨는가 잔류 세균을 제거해도 좋다 때까지 ddH 2 O로 1 배 펠릿 씻으십시오. 벌레가 유리에 집착로 supernatants를 제거하는 폴리 프로필렌 전송 pipettes를 사용하여(이 단계 이후부터 그것은 계란 생존의 손실을 방지하기위한 조치 사이의 시간을 최소화하....
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토론
여기에 제시된 방법은 C.에있는 시냅스의 대규모 인구에 대한 정량 멀티 파라미터 데이터를 추출하도록 설계되었습니다 elegans, 치료 그룹 내에서 일관성을 극대화하면서. 세 가지 특징은 이러한 목적에 기여한다. 첫째, immunostaining 모든 동물들이 같은 나이가되도록 동기 웜 집단에서 수행됩니다. 표현 수준의 발달 규정 실험적 치료의 효과를 흐릿하게 수 있기 때문에이 단계는 중요합니다 (예 : UNC-49 GABA 수용체 immunofluorescence는 동안 몇 배 차이가 개발 (K. 데이비스 외., 준비)). 또한 permeabilization 및 고정은 양적 비교는 어렵 만드는 고도의 변수가 될 수 있습니다. 동기화된 문화권을 사용하면 기술의 신뢰성 향상이 내재된 다양성을 최소화합니다. 이러한 다양성을 해결하는 다른 방법은 내부와 같은 독립적 시각이 될 수 무관한 대상으로 두 번째 항체를 사용하여 포함permeabilization위한 제어하거나 영상이 한꺼번에 .......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
저자 프로토콜의 개발 지원을위한 A. Benham 감사드립니다. 이 작품은 BAB에 NIH 교부금 NS06747 추진하는 사업
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | ||||||
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| 소프트웨어의 이름 | 회사 | 댓글 (옵션) | |||||||
| Volocity V4.0 이상 | PerkinElmer / Improvision | 이 소프트웨어에 액세스하려면 로컬 이미징 핵심 시설을 확인합니다. 데모 소프트웨어는 PerkinElmer 웹사이트에서 사용할 수 있습니다. 이 방법은 Volocity만을 Quantitation 모듈이 필요합니다. | |||||||
| 표 2. 특정 시약 및 장비. | |||||||||
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| 표 1. 솔루션. |
참고문헌
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E.
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