ADN vecteur basé sur l'interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

Résumé

L'interférence ARN (ARNi) possède de nombreux avantages sur inactivation du gène et a été largement utilisé comme un outil dans les études fonctionnelles de gènes. L'invention de l'ADN à base de vecteurs ARNi la technologie a fait à long terme et inactivation génique inductible possible, et a également augmenté la faisabilité de l'inactivation du gène In vivo.

Résumé

L'interférence ARN (RNAi) inhibe l'expression des gènes par ARN messagers cibles dégradant spécifiquement. Depuis la découverte de l'interférence double-brin d'ARN (siRNA) dans le gène silencieux ^1, l'ARNi est devenu un puissant outil de recherche dans les études des fonctions des gènes. Par rapport à délétion génétique, gene silencing RNAi-médiation possède de nombreux avantages, tels que la facilité avec laquelle elle est effectuée et son aptitude à la plupart des lignes de cellules. De multiples études ont démontré les applications de la technologie ARNi dans la recherche contre le cancer. En particulier, le développement de l'ADN à base de vecteurs technologie pour produire des petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) entraîné par le promoteur U6 ou H1 a fait à long terme et le gène inductible taire ^2,3 possible. Son utilisation en combinaison avec des vecteurs viraux génétiquement modifiés, tels que des lentivirus, facilite des rendements élevés de la prestation des shRNA et / ou l'intégration dans l'ADN génomique pour shRNA expression stable.

Nous décrivons une detaileprocédure d en utilisant l'ADN à base de vecteurs de technologie ARNi afin de déterminer la fonction des gènes, y compris la construction de vecteurs lentiviraux exprimant shRNA, la production de lentivirus et l'infection des cellules, et les études fonctionnelles utilisant un modèle de xénogreffe de souris.

Diverses stratégies ont été signalés dans la génération des constructions shRNA. Le protocole décrit ici employant amplification par PCR et une ligature 3-fragment peut être utilisé pour générer directement et de manière efficace shRNA-constructions contenant lentiviraux sans laisser de côté supplémentaire à une séquence nucléotidique codant shRNA. Étant donné que les cassettes d'expression shRNA-créés par cette stratégie peut être coupé par les enzymes de restriction, ils peuvent être facilement déplacés vers d'autres vecteurs avec différents marqueurs fluorescents ou un antibiotique. La plupart des réactifs de transfection commerciaux peuvent être utilisés dans la production de lentivirus. Toutefois, dans le présent rapport, nous fournissons une méthode économique en utilisant la précipitation au phosphate de calcium qui peut atteindre plus de l'efficacité de transfection de 90% enDes cellules 293T. Par rapport à constitutifs des vecteurs d'expression shRNA, un système inductible shRNA est particulièrement adapté pour abattre un gène essentiel à la prolifération cellulaire. Nous démontrons la gene silencing de Yin Yang 1 (YY1), un oncogène potentiel dans le cancer du sein ^4,5, par une inductible Tet-On shRNA système et de ses effets sur la formation de tumeurs. Les recherches utilisant des lentivirus nécessite un examen et d'approbation d'un protocole sur la biosécurité par le Comité de biosécurité de l'établissement d'un chercheur. Les recherches utilisant des modèles animaux nécessite un examen et d'approbation d'un protocole sur les animaux par le Comité de protection des animaux et l'utilisation (ACUC) de l'établissement d'un chercheur.

Protocole

1. Génération de constructions shRNA

1. Identifier une séquence siRNA-cible (20-23 nucléotides) sur la base de critères préalablement publiés ⁶ ou utiliser un serveur algorithme basé sur le Web, tels que "Finder cible siARN" de Ambion et GenScript.
2. Synthétiser des oligonucléotides basés sur la conception de séquences Figure 1 et par exemple dans le tableau 1. Effectuer l'amplification par PCR en utilisant le P1 et P2 oligonucléotides (30 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 secondes, un recuit à 60 ° C pendant 30 sec, et élongation à 72 ° C pendant 30 secondes) et un plasmide portant le U6 ou H1....

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour abattre un gène à l'aide shRNA et de visualiser son effet biologique en utilisant l'imagerie bioluminescente de la croissance des cellules tumorales in vivo. Le site cible d'un shRNA ne doit contenir aucun des trois sites de restriction (BamHI, HindIII et EcoRI) utilisé pour sous-clonage. Dans un scénario rare lorsque l'un quelconque de ces sites est présent, une enzyme de restriction supplémentaire peut être utilisée pour la remplacer dans la génération de l.......

Matériaux

En plus de l'équipement de laboratoire couramment utilisé pour l'ARN et analyses de protéines et de la culture cellulaire, les matériaux et réactifs suivants sont requis pour ce protocole.

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif
Prévention des risques biotechnologiques approprié pour le niveau de biosécurité 2 de confinement du Cabinet
PCR thermocycleur
Ultracentrifugeuse
Anesthésie-induction de chambre avec des charognards isoflurane
Pied à coulisse numérique
IVIS système d'imagerie
Très compétentes DH5a E. coli
Enzymes de restriction EcoRI, BamHI, HindIII et
ADN ligase T4
Troisième génération plasmides lentivirus emballage VSV-G, pRSV-Rev et pMDLg / pRRE

Liste des matériaux