RNA interference (RNAi) possiede molti vantaggi rispetto knockout del gene ed è stato ampiamente utilizzato come strumento in studi di geni funzionali. L'invenzione di DNA vettoriale basata RNAi tecnologia ha fatto lungo termine e smontabile gene inducibile possibile, e anche aumentata la possibilità di silenziamento genico In vivo.
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Articolo metodologico
DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro
In questo articolo
Sommario
Abstract
RNA interference (RNAi) inibisce l'espressione genica attraverso mRNA bersaglio specifico degradanti. Dalla scoperta del double-stranded RNA interference piccola (siRNA) in silenziamento genico 1, RNAi è diventato un potente strumento di ricerca in studi di funzione del gene. Rispetto a delezione genetica, RNAi-mediata silenziamento genico possiede numerosi vantaggi, come la facilità con cui viene effettuata e la sua idoneità per più linee cellulari. Molteplici studi hanno dimostrato le applicazioni della tecnologia RNAi nella ricerca sul cancro. In particolare, lo sviluppo della tecnologia del DNA vettoriale basato su di produrre piccole forcina RNA (shRNA) guidato dal promotore U6 o H1 ha reso lungo termine e gene inducibile silenziamento possibile 2,3. Il suo impiego in combinazione con geneticamente vettori virali, quali lentivirus, facilita elevato rendimento di consegna shRNA e / o integrazione nel DNA genomico per espressione stabile shRNA.
Descriviamo un detaileprocedura d con il vettore basato su tecnologia del DNA RNAi per determinare la funzione del gene, compresa la costruzione di vettori lentivirali esprimenti shRNA, la produzione di lentivirus e l'infezione delle cellule, e studi funzionali utilizzando un modello di xenotrapianto mouse.
Varie strategie sono stati riportati nella generazione di costrutti shRNA. Il protocollo qui descritto impiegando amplificazione PCR e un 3-frammento legatura può essere utilizzato per generare direttamente ed efficacemente shRNA contenenti costrutti lentivirali senza lasciare alcuna ulteriore adiacente ad una sequenza nucleotidica codificante shRNA. Poiché le shRNA-cassette di espressione creato da questa strategia può essere tagliato con enzimi di restrizione, possono essere facilmente spostato con altri vettori diversi marcatori fluorescenti o antibiotici. Reagenti di trasfezione più commerciali possono essere utilizzati nella produzione lentivirus. Tuttavia, in questa relazione, mettiamo a disposizione un metodo economico utilizzando fosfato di precipitazione di calcio che può raggiungere oltre il 90% di efficienza di transfezione inCellule 293T. Rispetto ai vettori di espressione shRNA costitutivi, un sistema inducibile shRNA è particolarmente adatto ad abbattere un gene essenziale per la proliferazione cellulare. Dimostriamo il silenziamento del gene Yin Yang 1 (YY1), un oncogene potenziale nel cancro della mammella 4,5, da un Tet-On sistema inducibile shRNA ei suoi effetti sulla formazione di tumori. La ricerca che utilizza lentivirus richiede l'esame e l'approvazione di un protocollo sulla biosicurezza dal Comitato di Biosicurezza di istituzione di un ricercatore. La ricerca che utilizza modelli animali richiede l'esame e l'approvazione di un protocollo animale dalla cura degli animali e Comitato uso (ACUC) dell'istituzione di un ricercatore.
Protocollo
1. Generazione di costrutti shRNA
- Identificare un siRNA sequenza-target (20-23 nucleotidi) sulla base di criteri precedentemente pubblicati 6 o utilizzare un web server basato su algoritmo, ad esempio "Finder siRNA Target" da Ambion e GenScript.
- Sintetizzare oligonucleotidi basato sul disegno della Figura 1 e sequenze esempio in Tabella 1. Effettuare amplificazione PCR utilizzando oligonucleotidi P1 e P2 (30 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 sec, ricottura a 60 ° C per 30 sec, e allungamento a 72 ° C per 30 sec) e un plasmide trasportante il U6 o H1 promotore come modello. Purificare il prodotto d....
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Discussione
Questo protocollo descrive un metodo per abbattere un gene utilizzando shRNA e visualizzare il suo effetto biologico utilizzando l'imaging bioluminescente di crescita di cellule tumorali in vivo. Il sito bersaglio di un shRNA non dovrebbe contenere uno qualsiasi dei tre siti di restrizione (BamHI, EcoRI e HindIII) utilizzati per subcloning. In uno scenario raro quando uno di questi siti è presente, un enzima di restrizione aggiuntivo può essere utilizzato per sostituirlo nel generare il costrutto.
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Grants Scholar di ricerca (RSG-116403-09-082-01-MGO) dalla American Cancer Society e fondi intramurali della Wake Forest University Health Sciences a GS. DBS è stato sostenuto da NCI formazione concessione 5T32CA079448.
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Materiali
Oltre alle attrezzature di laboratorio comunemente utilizzato per le analisi di RNA e proteine e la cultura delle cellule, i seguenti materiali e reagenti sono necessari per questo protocollo.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | |||
| Biosicurezza adatto per livello di biosicurezza 2 contenimento Cabinet | |||
| PCR termociclatore | |||
| Ultracentrifuga | |||
| Anestesia-induzione da camera con spazzini isofluorano | |||
| Digital Vernier pinza | |||
| IVIS sistema di imaging | |||
| Altamente competenti DH5a E. coli | |||
| EcoRI, BamHI, e gli enzimi di restrizione HindIII | |||
| DNA ligasi T4 | |||
| Di terza generazione lentivirus plasmidi imballaggio VSV-G, PRSV-Rev e pMDLg / pRRE |
Elenco dei materiali
Riferimenti
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Ac....
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Ristampe e permessi
