RNA干扰（RNAi）相较于基因敲除具有多种优势，已被广泛用作基因功能研究的工具。基于DNA载体的RNAi技术的发明使得长期且可诱导的基因沉默成为可能，同时也提高了基因沉默的可行性。 体内.
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摘要
摘要
RNA干扰（RNAi）通过特异性降解靶标mRNA来抑制基因表达。自从在基因沉默中发现双链小干扰RNA（siRNA）以来1，RNAi已成为基因功能研究中一种强大的研究工具。与基因敲除相比，RNAi介导的基因沉默具有多种优势，例如操作简便，并适用于大多数细胞系。多项研究已证实RNAi技术在癌症研究中的应用价值。特别是基于DNA载体的技术的发展，使得在U6或H1启动子驱动下产生小发夹RNA（shRNA）成为可能，从而实现长期且可诱导的基因沉默2,3。将其与基因工程改造的病毒载体（如慢病毒）联合使用，可显著提高shRNA的递送效率和/或在基因组DNA中的整合效率，以实现稳定的shRNA表达。
我们描述了一种利用基于DNA载体的RNA干扰技术来确定基因功能的详细实验步骤，包括表达shRNA的慢病毒载体的构建、慢病毒的制备与细胞感染，以及利用小鼠异种移植模型进行的功能研究。
已有多种策略被报道用于生成shRNA载体。本文所述的方案采用PCR扩增和三片段连接法，可直接高效地构建含有shRNA的慢病毒载体，且在shRNA编码序列旁不残留任何额外核苷酸。由于通过该策略构建的shRNA表达盒可被限制性内切酶切割，因此可轻松转移至带有不同荧光标记或抗生素抗性标记的其他载体中。大多数商用转染试剂均可用于慢病毒的生产。然而，本报告提供了一种经济的方法——使用磷酸钙沉淀法，在293T细胞中可实现超过90%的转染效率。与组成型shRNA表达载体相比，诱导型shRNA系统特别适用于敲低对细胞增殖至关重要的基因。我们通过Tet-On诱导型shRNA系统实现了对乳腺癌潜在癌基因Yin Yang 1（YY1）4,5的基因沉默，并展示了其对肿瘤形成的影响。使用慢病毒的研究需经研究人员所在机构生物安全委员会对生物安全方案进行审查和批准。使用动物模型的研究需经研究人员所在机构动物护理与使用委员会（ACUC）对动物实验方案进行审查和批准。
方案
1. 生成shRNA载体
- 根据已发表的标准6确定一个siRNA靶序列（20-23个核苷酸），或使用基于网络的算法服务器，例如Ambion和GenScript提供的“siRNA Target Finder”。
- 根据图1的设计以及表1中的示例序列合成寡核苷酸。以携带U6或H1启动子的质粒为模板，使用寡核苷酸P1和P2进行PCR扩增（94 °C变性30秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，共30个循环）。使用PCR纯化柱纯化PCR产物。用BamHI和HindIII酶切该产物，并使用PCR纯化柱纯化酶切后的DNA。将寡核苷酸P3和P4（每种2.5 pmol/μl，共100 μl，溶于50 mM Tris•HCl，pH 8.0）煮沸5分钟使其退火，然后缓慢冷却至室温。用BamHI和EcoRI酶切慢病毒载体（如图2A所述），并进行凝胶纯化。
- 将BamHI/EcoRI酶切的载体、BamHI/HindIII酶切的PCR片段以及一对已退火的寡核苷酸（在两端形成HindIII和EcoRI位点）按1:10:10的摩尔比进行三片段连接（图1）。
- 将连接产物转化至高效感受态E. coli DH5α细胞中。使用位于载体中的寡核苷酸P5和位于H1或U6启动子中的P6筛选阳性克隆7
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讨论
本方案描述了一种利用shRNA敲低基因并通过对肿瘤细胞在体内的生长进行生物发光成像来可视化其生物学效应的方法。in vivo。shRNA的靶位点不应包含用于亚克隆的三个限制性酶切位点（BamHI、HindIII和EcoRI）。在极少数情况下，若靶位点包含上述任一酶切位点，可选用其他限制性内切酶替代，以构建相应的载体。
本方案中有几个关键步骤可加快shRNA慢病毒载体的构建。首先，含有U6或H1启动子的PCR模板质粒，其抗生素抗性基因（如卡那霉素）可能与慢病毒载体（通常为氨苄青霉素）不同，这有助于降低由模板质粒引起的转化背景。其次，必须使用具有高效转化能力的感受态E. coli细胞。可采用基于钾离子和锰离子的方法制备转化效率极高的感受态E. coli细胞12。第三，可引入筛选标记以促进三片段亚克隆。例如，可对慢病毒载体进行改造，使其包含一个β-半乳糖苷酶（LacZ）表达盒，该表达盒将被PCR产物片段以及退火后的P3/P4寡核苷酸插入所替换。在此情况下，当存在插入片段的重组质粒在X-gal（5-溴-4-氯-3-.......
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致谢
本工作部分由美国癌症协会的研究学者资助（116403-RSG-09-082-01-MGO）以及维克森林大学健康科学的内部资金支持，资助对象为 GS。DBS 由美国国家癌症研究所培训资助 5T32CA079448 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 除了用于RNA和蛋白质分析及细胞培养的常规实验设备外，本实验方案还需以下材料和试剂。 | |||
| 适用于生物安全二级防护的生物安全柜 | |||
| PCR扩增仪 | |||
| 超速离心机 | |||
| 带异氟烷废气清除系统的麻醉诱导舱 | |||
| 数字游标卡尺 | |||
| IVIS 成像系统 | |||
| 高感受态 DH5a 大肠杆菌 | |||
| EcoRI, BamHI, &和 HindIII 限制性内切酶 | |||
| T4 DNA连接酶 | |||
| 第三代慢病毒包装质粒 VSV-G、pRSV-Rev 和 pMDLg/pRRE | |||
| <强>材料清单 |
参考文献
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Ac....
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