Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien Ca 2 + Handhabung, Mitochondrienmembranpotentials und mitochondriale Volumen. Das Verfahren zur Beantragung hochwertige und funktionale Herzmitochondrien wird ebenfalls beschrieben.
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Methodenartikel
Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das mitochondriale Permeabilitätsübergang Pore (mtPTP) ein nicht spezifischen Kanal, der in der inneren mitochondrialen Membran bildet für gelöste Stoffe mit einem Molekulargewicht kleiner als 1,5 kDa transportieren. Obwohl die definitive molekulare Identität der Pore wird noch diskutiert, tragen Proteine wie Cyclophilin D, VDAC und ANT zur Bildung mtPTP. Während die Beteiligung von mtPTP Öffnung in Zelltod gut 1 festgelegten vermehrt Hinweise darauf gibt, dass die mtPTP eine physiologische Rolle dient während mitochondriale Ca 2 +-Homöostase 2, Bioenergetik und Redox Signaling 3.
mtPTP Öffnung durch Matrix Ca 2 + ausgelöst aber seine Aktivität kann durch verschiedene andere Faktoren, wie oxidative Stress, Adeninnucleotid Depletion, hohe Konzentrationen von Pi, Mitochondrienmembran Depolarisation oder Entkuppeln und langkettigen Fettsäuren 4 moduliert. In vitro mtPTP Öffnung kann ach seinieved durch Erhöhen Ca 2 +-Konzentration innerhalb der mitochondrialen Matrix durch exogene Zugabe von Ca 2 + (Calcium Retention Capacity). Wenn Ca 2 +-Spiegel in den Mitochondrien zu erreichen eine bestimmte Schwelle, wird das mtPTP und erleichtert Ca 2 +-Freisetzung, die Ableitung des Protons treibende Kraft, Membranpotential Kollaps und eine Erhöhung der mitochondrialen Matrix Volumen (Schwellung), die letztlich zum Bruch der äußeren Membran der Mitochondrien und irreversiblen Verlust der Organellen-Funktion.
Hier beschreiben wir eine fluorimetrischen Assay, die für eine umfassende Charakterisierung der mtPTP Öffnung in isolierten Maus-Mitochondrien ermöglicht. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von 3 mitochondrialen Parameter verändert, wenn mtPTP Öffnung eintritt sind: mitochondrialen Ca 2 +-Handling (Aufnahme und Abgabe, wie durch Ca2 +-Konzentration im Testmedium gemessen), Mitochondrienmembranpotential und mitochondrial Volumen. Die Farbstoffe für Ca 2 +-Messung eingesetzt im Testmedium und Mitochondrienmembranpotential sind Fura FF, einer Membran impermeante, ratiometrisch Indikator, der eine Verschiebung in der Anregungswellenlänge in Gegenwart von Ca 2 + und JC-1, ein kationisches erfährt, ratiometrische Indikator, grün oder rot Monomeren Aggregate bildet bei niedrigen und hohen Membranpotential sind. Veränderungen im mitochondrialen Volumens erfolgt durch Aufnahme Lichtstreuung durch den mitochondrialen Suspension gemessen. Da qualitativ hochwertige, funktionelle Mitochondrien für die mtPTP Öffnung Assay erforderlich sind, beschreiben wir auch die notwendigen Schritte zu erhalten intakt, stark gekoppelte und funktionelle isolierten Herzen Mitochondrien.
Protokoll
Ein. Isolierung von Mitochondrien aus Maus Herz
- Zu isolieren Herzen Mitochondrien, zu betäuben und zu opfern Mäusen nach den Verfahren von Ihrem lokalen Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
Hinweis: Alle Schritte der Mitochondrien isoliert Protokoll muss auf Eis durchgeführt werden. Verwenden eiskalten Puffer und vorgekühlten Petrischalen, Falcon-Röhrchen und Eppendorf-Röhrchen. Die Volumina im Protokoll angegeben ist, für eine Probe mit 2 Mäuseherzen.
- Entfernen Herzen, legen Sie sie in kaltem Mitochondrien Isolation Buffer (300 mM Saccharose, 10 mM Na-HEP....
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Diskussion
Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt die notwendigen experimentellen Schritte permeability transition pore Öffnung in isolierten Herzen Mitochondrien (Abbildung 1 und Abbildung 4) zu beurteilen: das Verfahren zur Isolierung von Maus-Mitochondrien, die Atemwege Steuerelemente, die ihre Integrität und Funktionalität zu gewährleisten, die mitochondriale Parameter während überwacht mtPTP Öffnung und die Farbstoffe für ihre Messung eingesetzt, die Einrichtung des spektrofluorometrisch.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von HL094536 (BJH) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Trypsin-Inhibitor (Sojabohne) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Natriumhydrosulfit | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrom c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue Grinder Potter-Elvehjem mit Teflon Pistill 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Rührwerk | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperaturgesteuerten Sauerstoffelektrode) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 duale Emission Spektrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
Referenzen
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
