פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca מיטוכונדריה 2 + טיפול, קרום נפח פוטנציאלי ומיטוכונדריה המיטוכונדריה. ההליך לקבלת לב איכותי ופונקציונלי המיטוכונדריה הוא גם תאר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה
במאמר זה
סיכום
תקציר
נקבובי מעבר חדירות המיטוכונדריה (mtPTP) הוא ערוץ מסוים שאינם נוצר בקרום המיטוכונדריה הפנימי להובלה מומסת עם מסה מולקולרית קטנה מ -1.5 kDa. למרות הזהות המוחלטת המולקולרית של נקבובי היא עדיין תחת דיון, חלבונים כגון cyclophilin D, VDAC וANT לתרום להיווצרות mtPTP. למרות המעורבות של פתיחת mtPTP במוות של תאים מבוססת היטב 1, מצטבר ראיות מצביע על כך שmtPTP משרת תפקיד פיסיולוגי במהלך המיטוכונדריה Ca 2 + הומאוסטזיס 2, bioenergetics וחמזור איתות 3.
פתיחת mtPTP מופעלת על ידי מטריקס Ca 2 + אבל פעילותו יכולה להיות מווסתת על ידי מספר גורמים אחרים כגון סטרס חמצונים, דלדול נוקלאוטיד אדנין, ריכוזים גבוהים של פי, שלילת קוטביות הקרום המיטוכונדריה או תרה, וחומצות שומן ארוכת שרשרת 4. במבחנה, mtPTP פתיחה יכולה להיות achieved על ידי הגדלת ריכוז + Ca 2 בתוך מטריצת המיטוכונדריה באמצעות תוספת חיצונית של Ca 2 + (קיבולת אצירת סידן). כאשר Ca 2 + רמות בתוך המיטוכונדריה מגיע לסף מסוים, ומאפשר mtPTP פותח Ca 2 + שחרור, פיזורו של כוח מניע הפרוטונים, קריסת פוטנציאל קרום וגידול בהיקף מטריקס המיטוכונדריה (נפיחות) שסופו של דבר מוביל לקרע של קרום חיצוני של המיטוכונדריה ואובדן בלתי הפיך של תפקוד אברון.
כאן אנו מתארים assay fluorometric המאפשר אפיון מקיף של פתיחת mtPTP בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של 3 פרמטרי המיטוכונדריה ששינו כאשר פתיחת mtPTP מתרחשת: המיטוכונדריה Ca 2 + הטיפול (ספיגה ושחרורו, כפי שהיא נמדדת על ידי Ca 2 + ריכוז במדיום assay) פוטנציאלית, מיטוכונדריה ממברנה, וmitochoנפח ndrial. את הצבעים המועסקים על Ca 2 + מדידה במדיום assay ופוטנציאל הקרום המיטוכונדריה הם Fura FF, impermeant קרום, מחוון ratiometric שעובר שינוי באורך גל העירור בנוכחות Ca 2 +, וJC-1, קטיוני, מחוון ratiometric המהווה מונומרים ירוקים או אדומים אגרגטים בפוטנציאל קרום נמוך וגבוה, בהתאמה. שינויים בהיקף המיטוכונדריה נמדדים על ידי הקלטת פיזור אור על ידי ההשעיה של המיטוכונדריה. מאז באיכות גבוהה, המיטוכונדריה פונקציונלית נדרשות לבדיקת פתיחת mtPTP, אנחנו גם מתארים את הצעדים הדרושים כדי להשיג לב שלם, בשילוב ומאוד פונקציונלי מבודד המיטוכונדריה.
פרוטוקול
1. בידוד של המיטוכונדריה מלב מאוס
- כדי לבודד לב מיטוכונדריה, להרדים ולהקריב עכברים בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים המקומי וועדת שימוש.
הערה: כל השלבים של פרוטוקול בידוד המיטוכונדריה חייב להתבצע על קרח. השתמש במאגרים קרים כקרח ומנות מראש מצוננות פטרי, צינורות וצינורות פלקון Eppendorf. הכרכים שניתנו בפרוטוקול הם למדגם המכיל 2 לבבות של עכברים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המובא כאן מתאר את הצעדים הניסיוניים הדרושים כדי להעריך פתיחה נקבובית מעבר חדירות בלב מיטוכונדריה מבודד (איור 1 ואיור 4): ההליך לבידוד לב העכבר מיטוכונדריה, פקדי נשימה המבטיחים יושרה והפונקציונלית שלהם, פרמטרים המיטוכונדרי במעקב במהלך פתיחת mtPTP ואת הצבעים המועסקים למדידתם, הקמת מכשור spectrofluorometric, והאפיון של פתיחת mtPTP. Spectrofluorometer המועסק בפרוטוקול זה מאפשר מדידה מהירה של השלושה הפרמטרים הללו בו זמנית. עם זאת, הפרוטוקול הבסיסי יכול להיות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי HL094536 (BJH).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | |
| טריפסין | סיגמה אולדריץ | T3030 | |
| טריפסין המעכב (סויה) | סיגמה אולדריץ | T9128 | |
| hydrosulfite נתרן | סיגמה אולדריץ | 71699 | |
| Rotenone | סיגמה אולדריץ | R8875 | |
| ציטוכרום C | סיגמה אולדריץ | C7752 | |
| Alamethicin | סיגמה אולדריץ | A4665 | |
| CCCP | סיגמה אולדריץ | C2759 | |
| ציקלוספורין | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| מטחנת רקמה פוטר-Elvehjem עם טפלון העלי 15 מ"ל | תעשיות ויטון | ||
| stirrer העילי | תעשיות ויטון | 903475 | |
| Oxytherm (אלקטרודה חמצן הטמפרטורה המבוקרת) | Hansatech מכשירים | ||
| spectrofluorometer הפליטה QuantaMaster 80 כפול | פוטון טכנולוגית International, Inc |
מקורות
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
