Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm içerir 2 + Taşıma, mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal hacmi. Mitokondri, yüksek kaliteli ve fonksiyonel kalp elde edilmesi için işlem de tarif edilmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü
Bu makalede
Özet
Özet
Mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek (mtPTP) 1.5 kDa daha küçük bir moleküler kütleye sahip çözünenlerin taşımak için iç mitokondrial membran oluşturan bir non spesifik kanalıdır. Gözenek kesin moleküler kimlik tartışmasının altında hala olmasına rağmen, bu tür Siklofilin D VDAC ve ANT gibi proteinlerin oluşumunu mtPTP katkıda bulunur. Hücre ölümü mtPTP açılış tutulumu iyi 1 yerleşmiş olmakla birlikte, biriken kanıtlar mtPTP mitokondrial Ca 2 + homeostaz 2, biyoenerji ve redoks 3 sinyal sırasında bir fizyolojik rol oynar belirtir.
mtPTP açılış matrisi Ca 2 ile tetiklenir + ama faaliyet gibi oksidatif stres, adenin nükleotid tükenmesi, Pi yüksek konsantrasyonlarda, mitokondriyal membran depolarizasyon veya ayrılmasının ve 4 uzun zincirli yağ asitleri gibi diğer bazı faktörler tarafından modüle edilebilir. vitro, mtPTP yılında açılması ACH olabilirCa 2 + eksojen eklemeler (kalsiyum tutma kapasitesi) ile mitokondrial matriks içine Ca 2 + konsantrasyonu arttırarak ieved. Ca 2 mitokondri içindeki + düzeyleri belirli bir eşiğin ulaştığınızda, mtPTP açar ve Ca 2 kolaylaştırır + sürümü, proton itici güç yitimi, membran potansiyeli çöküşü ve sonuçta rüptürü yol mitokondrial matriks hacmi (şişlik) bir artış dış mitokondriyal membran ve organel fonksiyon geri dönüşümsüz kaybı.
Burada mitokondri izole fare kalbinde mtPTP açılış kapsamlı karakterizasyonu sağlar florometrik tahlil açıklar. Mitokondrial Ca 2 + işleme (as Ca 2 tarafından tahlil orta + konsantrasyonu ölçülen alımı ve salınımı,), mitokondrial membran potansiyeli ve mitocho: assay mtPTP açılış oluşur değişmiş 3 mitokondriyal parametrelerin eş zamanlı ölçümü içerirndrial hacmi. Ca2 için kullanılan renklendiriciler deney ortamı ile mitokondriyal zar potansiyeli + ölçüm Fura FF, bir zar laktobionat, Ca 2 + ve JC-1, bir katyonik varlığında uyarma dalga boyunda bir değişim geçirir rasyometrik gösterge vardır sırasıyla, düşük ve yüksek membran potansiyelinde yeşil monomerlerin veya kırmızı agregaları rasyometrik göstergesi. Mitokondriyal hacmindeki değişiklikler mitokondriyal süspansiyon ışık saçılması kaydederek ölçülür. Yüksek kaliteli, fonksiyonel mitokondri mtPTP açılış tahlil için gerekli olduğundan, biz de sağlam, son derece birleştiğinde ve fonksiyonel izole kalp mitokondri elde etmek için gerekli adımları açıklar.
Protokol
1. Fare Kalpten Mitokondri İzolasyonu
- Kalp mitokondri izole etmek, uyutmak ve yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış prosedürlere göre fareler kurban.
Not: mitokondri izolasyon protokolü tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır. Buz soğuk tamponlar ve ön soğutulmuş Petri kapları, Falcon tüpleri ve Eppendorf tüpleri kullanın. Protokolü verilen hacimleri 2 fare kalpleri içeren bir örnek içindir.
- , Kalpler kaldırma soğuk Mitokondri İzolasyonu tampon içine yerleştirin (300 mM sukroz, 10 mM Na-HEPES, 200 mM EDTA, pH 7.4) ve kan durulayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan protokol mitokondri izole kalp (Şekil 1 ve Şekil 4) permeabilite geçiş gözenek açılması değerlendirmek için gerekli deney adımları açıklar: fare kalp mitokondri izolasyon prosedürü, bütünlük ve işlevselliği sağlamak solunum kontrolleri, mitokondriyal parametreleri sırasında takip mtPTP açılış ve ölçüm için kullanılan boyalar, spektrofluorometrik enstrümantasyon, kurma ve mtPTP açılış karakterizasyonu. Bu protokol istihdam spectrofluorometer aynı anda bu üç parametrenin hı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu eser HL094536 (BJH) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| Tripsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Tripsin inhibitörü (soya) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodyum hidrosülfit | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenon | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Sitokrom c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Bir Siklosporin | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Doku değirmeni Teflon havaneli 15 ml Potter-Elvehjem | Wheaton Sektörler | ||
| Tepegöz karıştırıcı | Wheaton Sektörler | 903475 | |
| Oxytherm (sıcaklık kontrollü oksijen elektrodu) | Hansatech Aletleri | ||
| QuantaMaster 80 çift emisyon spectrofluorometer | Foton Technology International, Inc |
Kaynaklar
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
