使用抗体阵列分析受体酪氨酸激酶磷酸化的变化 - 广告

摘要

Proteome Profiler 抗体阵列是一种方便且经济高效的方法，无需进行大量免疫沉淀 （IP） 蛋白质免疫印迹即可筛选受体酪氨酸激酶 （RTK） 磷酸化的变化。ARY001 人 RTK 阵列允许使用化学发光检测对单个样品中的多个 RTK 进行定性测量。

摘要

受体酪氨酸激酶 （RTK） 表达和磷酸化的失调通常与癌细胞的发生和转移扩散有关。^1-3 人们将大量精力集中在开发靶向特定 RTK 的抑制剂并中断与疾病状态相关的异常信号通路。^4-7 本研究的目的是测量选定数量的抑制剂对 RTK 磷酸化的影响。本研究使用了人磷酸化 RTK 芯片，这是一种基于膜的夹心免疫测定法，可同时监测单个样品中多个 RTK 的磷酸化增加或减少。在该检测中，裂解物样品中存在的磷酸化和非磷酸化 RTK 都被印在显微镜载玻片大小的硝酸纤维素膜上一式两份的离散抗体捕获。洗涤后，将阵列与抗磷酸酪氨酸辣根过氧化物酶 （HRP） 一起孵育，HRP 与阵列上捕获的磷酸化 RTK 夹在一起。在第二个洗涤步骤之后，将阵列与化学发光试剂一起孵育。在每个阵列位点产生的信号与每个捕获抗体结合的磷酸蛋白量成正比。在这些实验中，芯片用于测量 MDA-MB-453 乳腺癌或 KATO III 胃癌细胞配体刺激后磷酸化的增加，以及表征与用对 ErbB 或 FGF R 家族成员选择性的抑制剂处理细胞相关的磷酸化降低。

方案

1. 样品制备

1. 按照人磷酸化 RTK 阵列数据表中的指南，从未处理、配体处理或抑制剂和配体处理的细胞中收集裂解物。裂解缓冲液已针对该试剂盒进行了优化。替换其他裂解缓冲液可能会影响阵列的最终性能。为防止蛋白水解样品降解，将 10 μg/ml 抑肽酶、10 μg/ml 亮肽素和 10 μg/ml 胃蛋白酶抑制剂 A 添加到每次使用新鲜的每种细胞裂解物制备物所需的裂解缓冲液体积中。
2. 裂解物浓度应使用二辛可宁酸 （BCA） 测定法测量。可以根据经验调整样品浓度以获得最佳灵敏度和低背景。建议将 100-300 μg 裂解物的范围作为初始起点。
3. 应避免样品的冻融循环，并且需要正确储存裂解物以获得最佳性能。在冰上解冻冷冻裂解物样品。

2. 阵列检测

1. 使用前将所有试剂盒组分置于室温下。为避免污染，请在执行程序时戴上手套。
2. 将 2.0 ml 阵列缓冲液 1 移液到要使用的 4 孔多培养皿的每个孔中。Array Buffer 1 用作块缓冲区。
3. 使用平头镊子，从保护片之间取下要使用的每层膜，并放入 4 孔多培养皿的孔中。数组编号应朝上。
4. 与 Array Buffer 1 接触后，斑点中的蓝色染料会消失，但捕获抗体会保留在其特定位置。
5. 在摇床上孵育 1 小时。调整托盘的方向，使每个阵列在其孔中首尾相连。阵列的表面应完全润湿并被块缓冲区覆盖。
6. 当膜封闭时，用 Array Buffer 1 将所需量的细胞裂解物稀释至最终体积为 1.5 mL。
7. 从 4 孔多培养皿的孔中吸出阵列缓冲液 1，并加入稀释的裂解物溶液。盖上 4 孔多培养皿的盖子。
8. 在 2-8 °C 下在摇床上孵育过夜。如果不需要最佳灵敏度，可以使用较短的孵育时间。
9. 小心地从 4 孔多培养皿中取出每个膜，并放入装有 20 ml 1X 洗涤缓冲液的单独塑料容器中。4 孔多培养皿不能用于完成洗涤步骤。用去离子水或蒸馏水冲洗 4 孔多培养皿并彻底干燥。
10. 在摇床上用 1X 洗涤缓冲液洗涤每个膜 10 分钟。重复 2 次，总共洗涤 3 次。
11. 使用样品瓶标签上的稀释因子，在 1X 阵列缓冲液 2 中稀释抗磷酸酪氨酸辣根过氧化物酶 （HRP） 检测缓冲液。将 2.0 ml 稀释溶液移液到 4 孔多培养皿的每个孔中。
12. 小心地从洗涤容器中取出每片膜。让多余的缓冲液从膜中排出，并将膜返回到含有稀释的抗磷酸酪氨酸-HRP 的 4 孔多培养皿中。用盖子盖住孔。
13. 在室温下在摇床上孵育 2 小时。
14. 如前所述洗涤每个阵列。
15. 不间断地完成其余步骤。小心地从洗涤容器中取出每片膜。将下边缘吸干到吸水纸上，让多余的缓冲液从膜中排出。将每个膜放在塑料片保护膜上，识别号朝上。
16. 将 1 ml 制备好的 Chemi Reagent Mix 均匀地移液到每个膜上。每片膜使用少于 1 mL 的 Chemi Reagent Mix 可能会导致膜覆盖不完全。用一些高强度化学发光试剂代替 Chemi 试剂 1 和 2 可能会导致背景增加或信号减弱，具体取决于试剂。
17. 小心地用塑料片保护膜覆盖。轻轻抚平任何气泡，并确保 Chemi Reagent Mix 均匀地涂抹到每个膜的各个角落。孵育 1 分钟。
18. 将纸巾放在包含膜的塑料片保护膜的顶部和侧面，小心挤出多余的 Chemi Reagent Mix。
19. 取下顶部的塑料片保护膜，小心地将吸收性实验室湿巾放在膜顶部，以吸干任何残留的 Chemi Reagent Mix。
20. 将膜留在底部的塑料片保护膜上，用保鲜膜盖住膜，注意轻轻抚平任何气泡。将多余的塑料包装缠绕在纸张保护膜的背面，以便膜和纸张保护膜完全包裹。
21. 将识别号朝上的膜放入不用于放射性同位素检测的放射自显影胶片盒中。
22. 使用 Kodak BioMax Light 胶片曝光 1-10 分钟。建议进行多次曝光。或者，可以使用兼容化学发光的成像仪（如 Carestream Health Image Station 4000MM PRO）收集图像。

3. 数据分析

1. 通过将透明度叠加层放在阵列图像上，并将其与为此目的打印在角落中的参考点对对齐，可以快速识别显影胶片上看到的阳性信号。阵列上盖章的标识号应放在左侧。对照和捕获抗体的位置列在人磷酸化 RTK 阵列数据表的附录中。
2. 显影胶片上的像素密度可以使用 Epson Perfection V750 PRO 等透射模式扫描仪进行收集。
3. 创建一个模板，以使用适当的成像分析软件程序分析阵列每个点的像素密度。兼容的程序包括 GE 的 ImageQuant 或 ArrayVision 软件、带有特定于 Proteome Profiler Arrays 模板的 Western Vision 软件、BioRad Quantity One、Adobe Photoshop、NIH ImageJ 和 Protein Simple AlphaView。
4. 将信号值导出到电子表格文件，以便在 Microsoft Excel 等程序中进行作。
5. 确定代表每个 RTK 的一对重复点的平均信号（像素密度）。
6. 从每个点减去平均背景信号。使用来自阵列或阴性对照点的空白区域的信号作为背景值。
7. 比较不同阵列上的相应信号，以确定样品之间 RTK 磷酸化水平的相对变化。

4. 代表性结果

该方案演示了如何使用人磷酸化 RTK 阵列来筛选配体刺激和抑制剂对 RTK 磷酸化的影响。在图 1 中，显示了未处理、用 100 ng/ml rhNRG-β1/HRG-β1 （HRG-β1） 处理 5 分钟或在 HRGβ1 处理前用已知 ErbB 家族抑制剂^8-11 预处理的 MDA-MB-453 细胞的数据。对于抑制剂实验，将细胞与 1 μM HDS 029、200 nM PD 153035 或 200 nM PD 158780 在 SFM 中孵育 3 小时。每个阵列与 100 μg 裂解物一起孵育。将未处理的细胞与 HRG-β 处理的 MDA-MB-453 细胞进行比较时，观察到 ErbB2、ErbB3 和 ErbB4 捕获点的磷酸化增加。在 HRG-β 1 孵育之前用所有三种 ErbB 家族选择性抑制剂处理细胞导致 ErbB2、ErbB3 和 ErbB4 磷酸化减少。

在图 2 中，显示了已知过表达 RTK FGF R2 的 Kato III 细胞的数据。在这组实验中，Kato III 细胞未经处理，用 100 ng/ml rhFGF 酸性 （FGF） 和 1 μg/ml 肝素处理，或在用 FGF 和肝素处理之前用 FGF R 选择性抑制剂^12-15 预处理。抑制剂 PD173074、PD 161570 和 PD 166285 以 1 μM 的浓度使用，并与 Kato III 细胞在无血清培养基中孵育 3 小时。虽然在未经处理的 KATO III 细胞中 EGF R 和 FGF R2 均存在组成型磷酸化，但在 FGF 处理后观察到 FGF R2 磷酸化增加。用 PD 173074、PD 161570 或 PD 166285 孵育细胞导致 FGF R2 和 EGF R 磷酸化降低。尽管已知这些抑制剂会影响 FGF R 家族成员的磷酸化，但这些结果表明，人磷酸化 RTK 阵列可用于监测特定浓度的抑制剂可能对其他 RTK（例如本例中的 EGF R）产生的影响。

图 1.诱导和抑制乳腺癌细胞中受体酪氨酸激酶磷酸化。显示了来自 Proteome Profiler 人磷酸化 RTK 阵列的阵列图像和相应的直方图谱。MDA-MB-453 细胞未经处理或先用 RTK 抑制剂处理后再用 NRG-β1/HRG-β1 处理。该芯片用于监测抑制剂对 MDA-MB-453 细胞激酶磷酸化的影响。 单击此处查看大图。

图 2.胃癌细胞中受体酪氨酸激酶磷酸化的诱导和抑制。显示了来自 Proteome Profiler 人磷酸化 RTK 阵列的阵列图像和相应的直方图谱。Kato III 细胞未经处理或用 RTK 抑制剂处理，然后用 FGF 酸性和肝素处理。 单击此处查看大图。

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讨论

人磷酸化-RTK 是一种经济、快速的替代方法，可替代传统方法，例如免疫沉淀 （IP） 蛋白质印制，用于筛选 RTK 磷酸化的变化。使用该方法，使用MDA-MB-453或Kato III细胞裂解物的单个样品同时筛选42种磷酸化RTK的相对水平。此外，这种阵列测定需要 2.5 小时的动手时间，这使得该方法比执行多个 IP 西部片更具时间效率。通过采用化学发光检测方法，除了通常用于收集西方数据之外，不需要专门的设备。阵列很灵敏，可用于比较配体和抑制剂处理引起的磷酸化变化。该方法还允许评估抑制剂对脱靶RTK的选择性。可以使用ELISA等定量测定进一步评估阳性命中。

为了有效地利用阵列来筛选磷酸化的变化，应遵循一些关键的实验指南。首先，实验应包括适当的对照样品。例如，在这些实验中，在同一天制备的裂解物样品上测量了抑制剂对MDA-MB-453或Kato III裂解物的影响。应仅分析在同一实验中收集的阵列数据，以尽量减少由于样品处理、孵育时间、移液器技术或洗涤技术差异而导致的信号变化。不建议比较同一膜上两种分析物之间的信号强度，因为未选择具有平行亲和力的捕获抗体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人磷酸化 RTK 阵列试剂盒	R&D Sytems	ARY001
肽酶	Sigma	A6279
肽素	Tocris	1167
蛋白酶抑制剂A	Tocris	1190
MDA-MB-453
Kato III细胞
重组人 NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF 结构域	R&D Systems	396-HB-050
重组人 FGF 酸性 （aa 16-155）	R&D Systems	232-FA-025
肝素	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA 检测	Pierce	23225
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）
移液器和移液器吸头
手套
去离子水或蒸馏水
平头镊子
摇床平台
微量离心机
为 50 ml			用于清洗阵列
塑料透明片保护膜
保鲜膜
吸水性实验室湿巾
纸巾
放射自显影盒
胶片显影
	Carestream Health	178 8207
胶片显影
剂 Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		化学发光成像仪 与蛋白质印迹数据收集兼容，可代替胶片和胶片开发 人员。
爱普生完美扫描仪	爱普生	V750 PRO	带透明适配器的平板扫描仪，能够传输模式
图像分析软件	GE、WesternVision、BioRad、Adobe、NIH、Protein Simple 等		ImageQuant、ArrayVision、Western Vision、Quantity One、Photoshop、ImageJ、AlphaView 或其他兼容程序
Microsoft Excel	Microsoft
能够运行图像分析软件和 Microsoft Excel 的计算机。

抑亮胃细胞摇床容量 的塑料容器 剂 柯达 BioMax Light 胶片显影剂