골수 이식은 골수 유래 세포의 유전자형을 변경하는 방법을 제공합니다. 관심 유전자는 골수 유래 세포 및 비 골수 유래 세포 모두에 표현되어있는 경우, 골수 이식이 아닌 골수 유래 세포 유전자형을 변경하지 않고 다른 유전자형에 골수 유래 세포를 변경할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
대장염의 개발에 유전자의 역할을 이해하기 위해, 우리는 야생 타입 마우스 및 대장염에 대한 유전자 수준의 관심 결함 녹아웃 마우스의 반응을 비교했다. 유전자 수준의 관심은 골수 파생 세포와 호스트의 비 골수 유래 세포 모두에 표시되어있는 경우, 그러나, 골수 유래 세포 및 비 골수의 관심 유전자의 역할을 차별화 할 수 있습니다 골수 이식 기술에 의해 파생 된 세포. 마우스의 골수 유래 세포 유전자형을 변경하려면받는 마우스의 원래 골수는 방사선에 의해 파괴하고 다른 유전자형의 새로운 기증 골수로 대체되었습니다. 야생 형 쥐 기증 골수가 녹아웃 마우스에 이식되었을 때, 우리는 골수 유래 세포의 야생 형 유전자 발현과 녹아웃 마우스를 생성 수 있습니다. 또한,시 녹아웃 마우스 기증 골수는 유전자 수준의 관심을 표현하지 않고 야생 타입받는 마우스, 야생 형 생쥐에 이식 된골수에서 파생 된 세포가 생산되었다. 그러나, 골수 이식이 100 % 완료되지 않을 수 있습니다. 따라서, 우리는받는 마우스 및 골수 이식의 성공에 기증 골수 유래 세포의 비율을 추적하기 위해 기증자와받는 사람 세포의 마커로 차별화 (CD) 분자의 클러스터를 (CD45.1 및 CD45.2) 이용. CD45.2 유전자형과 CD45.1 유전자형과 녹아웃 쥐 야생 형 생쥐가 사용되었습니다. 받는 마우스 조사 후, 다른 genotypes의 기증 골수 세포가받는 마우스에 주입했다. 새로운 골수는 면역을 물려 생성하면, 생쥐는 대장염을 유발하는 화학 물질 에이전트 (dextran 나트륨 황산, DSS 5 %)에 의해 도전되었다. 여기 우리는 또한 마우스로 대장염을 유발하고 뼈 골수 유래 세포에서 표현의 관심 유전자의 역할을 평가하는 방법을 보여 주었다. 뼈 파생 된 세포에서 유전자 수준의 관심은 질병의 발전에 중요한 역할을 (예 : 대장균과 같은 재생되면살은), 골수 이식과 함께받는 생쥐의 표현형이 크게 변경 될 수 있습니다. 대장염 실험의 끝에서, 골수 혈액과 골수의 세포 CD45.1 및 CD45.2에 대한 항체와 라벨이 붙지 만, 존재의의 양적 비율은 유동 세포 계측법에 의한 골수 이식의 성공 여부를 평가하는 데 사용할 수 파생. 성공적인 골수 이식받는 사람 마우스의 골수와 혈액 모두에서받는 사람 유전자형 이상 기증 유전자형 (CD 분자 마커의 기간에)의 대부분을 표시합니다.
프로토콜
1. 전에 - 당신 - 시작 기술 고려 사항
- 해당 CD 분자와 마우스가 주요 마우스 공급 업체에서 구입 할 수 있기 때문 우리는 실험을 위해 C57/BL6 야생 형 마우스 및 녹아웃 마우스를 모두 사용하는 것이 좋습니다.
- 이 야생 타입 마우스와 골수 이식 후 기증자의 세포를 파생 녹아웃 마우스를 추적하기가 어렵습니다 때문에, 야생 형 생쥐를 표현하기 위해 CD45.1 마우스를 사용 할 필요가 있습니다. (CD45.1 C57/SJL WT 마우스 잭슨 연구소 주식 # 002014).
- 대부분의 마우스 식민지가 CD45.2 있습니다. 우리 녹아웃 마우스는 CD45.2 유전자형 (: 잭슨 연구소 주식 # 000664 대안 CD45.2 WT 마우스 소스)에 속한다. CD45.1 또는 CD45.2 유전자형의 결정은이 프로토콜의 제 7에서 설명 드린 바와 같이 골수 및 말초 혈액의 유동 세포 계측법을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
- 조사 후 마우스 면역을 훼손하고있다. 병원체 무료 시설의 생쥐세요.
- irradiator의 운영 특수 보안 clearanc가 필요합니다전자 및 교육. 교육 및 승인 과정에서 시간을 절약하기 위해, 그것은 irradiator를 작동 할 수 있습니다 자격을 갖춘 기술자와 실험실과 협력하는 것....
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결과
유전자 수준의 관심이 대장염의 개발 기간 동안 면역 세포에서 중요한 역할을 담당하는 경우, 쥐가 골수 이식 (WT KO 또는 WT에 KO로)를 통해 서로 다른 유전자형의 골수를받는 것은 DSS 대장염에 변경된 응답이 있어야합니다. 대장염의 심각도를 결정하기위한 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 colonic 조직의 H & E 염색입니다. Colonic 조직 구조 변화와 염증의 징후는 양적 H & E 조직학 점수 시스템에 의해 평가를 할 수 있습니다. H & DSS의 대장염 모델 E 조직학 점수에 대한 기준은 여기를 둘 발견 할 수 있습니다. 또한, 화학 유도 대장염은 trinitrobenzene 설 폰산 (TNBS)로 유도 할 수 있습니다. TNBS의 대장염 유도 및 H & E 조직학 점수 기준의 방법은 이전 발행 3에서 찾을 수 있습니다. 그룹 간의 조직 학적 소견으로 점수 차이는 학생의 t-테스트에 의해 분석 할 수 있습니다.
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토론
이 골수 이식 접근 방식은 면역학의 대장염의 연구, 감염, 암, 비만 및 기타 질병에 적합합니다. 이 골수 이식 실험은 유전자 수준의 관심은 모두 파생 골수와 비 골수 파생 세포와 유전자 수준의 관심이 어느 인구의 세포에 의해 병을 중재 것으로 의심되는 표현 할 때 필요합니다. 예를 들어, 항균 펩타이드 cathelicidin은 급성 대장염을 조절하기 위해 표시됩니다. 그러나 그것은 상피 세포와 면역 세포 (예 : 대 식세포 등) 모두에 표시됩니다. 그럼 우리가 마우스의 급성 대장염을 변조 세포의 어떤 인구 정의 할 뼈 이식을 사용했습니다. 대장염의 심각성이 크게 골수 이식을 통해 골수 cathelicidin의 genotypes의 변화 이후에 변경되었습니다. 그럼 우리가 DSS에 대한 응답으로 변조 급성 대장염에서 중요한 역할을 담당하고 골수 유래 세포로 표현 그 cathelicidin을 체결 할 수 있습니다.
뼈 mArrow 파생 된 세포는 일반적으로 적혈구, 백혈구와 혈소.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 UCLA-치료 센터, Crohn의 및 미국 경력 개발 상 (# 2691)와 건강 NIDDK K01 국립 연구소 (DK084256) 혼 와이 쿤에 대한 자금의 대장염 재단의 파일럿 및 타당성 연구 기금의 지원을받는되었다.
골수 방사선 작업 버나드 레빈과 AIDS 연구 마우스 / 인간 키메라의 핵심 시설에 대한 UCLA 센터의 스콧 주방이 도움이되었습니다. 유동 세포 계측법 작업은 UCLA 벡터 핵심 시설의 지원을했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 세포 염색 버퍼 | Biolegend | # 420201 | |
| 10X 적혈구 용해 버퍼 | Biolegend | # 420301 | |
| FITC 마우스 isotype 제어 | Biolegend | # 400207 | |
| PE 마우스 isotype 제어 | Biolegend | # 400211 | |
| PE 안티 - 마우스 CD45.2 | Biolegend | # 109807 | |
| FITC 안티 - 마우스 CD45.1 | Biolegend | # 110705 | |
| 안티 - 마우스 CD16/32 차단 | Biolegend | # 101301 | |
| 40 μm 셀 스트레이너 | Fisherbrand | # 22363547 | |
| PBS 1X | MP의 biomedicals | # 1860454 | |
| 헤파린 | Fisherbrand | # BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (어부) | |
| 소독약 IC | Andwin 과학 | NC9745686 (어부) | |
| Vaccutainer | BD | # 8000813 | |
| 마우스 restrainer | Braintree 과학 | # TV-150 | |
| Irradiator | JL 목자 사 | 제가 68A 표시 | |
| 흐름 cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| 흐름 cytometer 테스트 튜브 | 매 | # 352052 | |
| 디지털 캘리퍼스 | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | G0328QW |
참고문헌
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameli....
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재인쇄 및 허가
