Method Article

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

DOI:

10.3791/4209

⸱

January 27th, 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Anesthesiology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels
Posted by JoVE Editors on 10/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels. The Protocol section has been updated.

The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |

to:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم أساليب لتطوير والتحقق من صحة مقايسة الكمية مضان لقياس نشاط البوتاسيوم المعدل الداخل (قير) قنوات لفحص المجمع الإنتاجية العالية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافترض أعضاء معينة من البوتاسيوم المعدل الداخل الأسرة قناة (قير) أهداف المخدرات لمجموعة متنوعة من الاضطرابات، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، الرجفان الأذيني، و1،2 الألم. بالنسبة للجزء الأكبر، ومع ذلك، فقد تم التقدم تباطأ نحو فهم إمكاناتها العلاجية أو الوظائف الفسيولوجية الأساسية حتى لعدم وجود أدوات الدوائية جيدة. في الواقع، وتأخر في علم الصيدلة الجزيئية الأسرة المعدل الداخل بعيدا وراء ذلك من الفصيلة S4 من الجهد بوابات قنوات (كيلو فولت) البوتاسيوم، والتي تم اكتشافها في عدد من تقارب-nanomolar وانتقائية للغاية جهري السم الببتيد 3. السم سم النحل tertiapin ومشتقاته ومثبطات قوية من Kir1.1 وKir3 قنوات 4،5، ولكن الببتيدات ذات الاستخدام المحدود علاجية وكذلك تجريبيا نظرا لخصائص المستضدية والتوافر البيولوجي الفقراء والاستقرار الأيضية وانتفاذ الأنسجة. تطوير قويةوسوف انتقائية الصغيرة جزيء تحقيقات مع تحسين الخصائص الدوائية تكون مفتاحا لفهم علم وظائف الأعضاء بشكل كامل والإمكانات العلاجية من القنوات قير.

الجزيئية إنتاج مجسات مكتبات مركز شبكة (MLPCN) بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) قد خلق فرص الصندوق المشترك للعلماء الأكاديمية لبدء التحقيق حملات اكتشاف الجزيئية للأهداف ومسارات الإشارات في حاجة إلى أفضل الصيدلة 6. ويقدم الباحثون MLPCN الوصول إلى مراكز الفرز الصناعة على نطاق والكيمياء الطبية والمعلوماتية دعم لتطوير جزيء صغير تحقيقات لتوضيح وظيفة الجينات وشبكات الجينات. الخطوة الحاسمة في كسب الدخول إلى MLPCN هو وضع مقايسة المستهدفة أو مسار محدد، قوية قابلة للالفرز الفائق الإنتاجية (HTS).

هنا، نحن تصف كيفية تطوير مضان القائم على الثاليوم (TL +) تدفق أساذ وظيفة قناة قير للفحص مجمع عالية الإنتاجية 7،8،9،10. ويستند الفحص على نفاذية K + قناة المسام ليرة تركية K + + متجانس. ويستخدم الفلورسنت المتاحة تجاريا ثاليوم + مراسل صبغ للكشف عن تدفق عبر الغشاء من ثاليوم + من خلال المسام. هناك على الأقل ثلاثة الأصباغ المتاحة تجاريا التي هي مناسبة لفحوصات + ثاليوم تدفق: BTC، FluoZin-2، 7،8 وFluxOR. يصف هذا البروتوكول باستخدام مقايسة التنمية FluoZin-2. على الرغم من أن وضعت أصلا وتسويقها كمؤشر الزنك، FluoZin-2 المعروضات زيادة جرعة قوية وتعتمد على الانبعاثات في مضان على ثاليوم + ملزمة. بدأنا العمل مع FluoZin-2 قبل FluxOR كانت متاحة 7،8 واستمرت في القيام بذلك 9،10. ومع ذلك، فإن الخطوات في تطوير الفحص متطابقة أساسا لجميع الأصباغ الثلاثة، ويجب على المستخدمين تحديد أي صبغة هي الأنسب لن الخاصةeeds. نناقش أيضا مقاييس أداء الفحص أنه يجب التوصل للنظر في الدخول إلى MLPCN. منذ ثاليوم + يتخلل بسهولة أكثر K + قنوات، ينبغي أن تكون قابلة للتكيف مع مقايسة الأهداف الأكثر K + القناة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جيل من خطوط الخلايا مستقرة بولكلونل

  1. إنشاء خط جودة عالية معربا عن الخلية مستقرة قناة قير للاهتمام هو خطوة أولى هامة نحو تطوير قوية مقايسة الفرز الفائق الإنتاجية. يمكن التأسيسي K + قناة overexpression تؤدي إلى تفعيل مسارات موت الخلايا ومستقرة تنكس خط الخلية وفقدان أداء الفحص. لتجنب هذه المشاكل المحتملة وتوفير عنصر تحكم مريحة الداخلية من أجل التنمية مقايسة (انظر أدناه)، فمن المستحسن نظام التعبير التتراسيكلين-محرض 8.
  2. الثقافة الأبوية T-REX-HEK293 الخلايا باستخدام التقني....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام نظام التعبير التتراسيكلين-محرض يوفر عنصر تحكم مريحة الداخلية للتمييز ثاليوم + تدفق من خلال مسارات الذاتية وقناة قير للاهتمام. الشكل 1 يبين بعض الأمثلة من الخرائط المستخدمة في الطلاء الخلية أنواع مختلفة من التجارب. يشار إلى مواقف الآبار التي تحتوي على الخلايا أو التتراسيكلين uninduced صنع بألوان مختلفة. 2A الشكل يبين خريطة لوحة مصدر المستخدمة لتحديد تركيز الأمثل + ثاليوم للتنمية والفحص فحص المركبة. التدرج لون يمثل سلسل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيانات العلاج: حالما يتم جمع البيانات، وهي خطوة مشتركة في التحليل ينطوي على تطبيع استجابة كل بئر في مضان، F، إلى قيمته الأولية في بداية التجربة، F 0. ويشار إلى هذه على أنها "نسبة ثابتة" ويرمز "F / F 0". وفي الحالات التي يهيمن F 0 من الصبغة العملية مؤشر نسبة ثابتة إلى حد كبير سوف تصحيح لعوامل كثيرة مثل disuniformities في الإضاءة، وجمع الإشارة، والخلية رقم. في الحالات التي يكون فيها إشارة ضعيفة أو صبغ م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية بتمويل من المنح الصحة 1R21NS073097-01 و1R01DK082884 (JSD) ومؤسسة PIER11VCTR الوطنية منحة المعاهد.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم تعليقات
pcDNA5/TO إينفيتروجن V1033-20 التتراسيكلين-محرض التعبير ناقلات
T-REX-HEK293 الخلايا إينفيتروجن R71007 التتراسيكلين-محرض خلية خط
Lipofectamine LTX / زائد الكاشف إينفيتروجن 15338100 كاشف ترنسفكأيشن
FBS ATLANTA الحيوية S11550 وسائل الإعلام خلية ثقافة
DMEM إينفيتروجن 11965 وسائل الإعلام خلية ثقافة
هيغروميسين B إينفيتروجن 10687-010 وسائل الإعلام خلية ثقافة
Blasticidin S إينفيتروجن R210-01 وسائل الإعلام خلية ثقافة
البنسلين / الستربتوميسين إينفيتروجن 15140 وسائل الإعلام خلية ثقافة
HBSS-ثنائي التكافؤ مجانا Mediatech 21022CV خلية الغسيل
التربسين-0.25٪ Mediatech 25053CI خلية التفكك
التتراسيكلين، حمض الهيدروكلوريك سيجما T9823 الحث كاشف
مدال FBS ATLANTA الحيوية S12650 الطلاء وسائل الإعلام
FluoZin-2 إينفيتروجن F24189 صبغ فلوري
بلورونيك F-127 إينفيتروجن P-3000MP صبغة التحميل
HBSS إينفيتروجن 14175 مقايسة العازلة
HEPES إينفيتروجن 15630 مقايسة العازلة
NaHCO 3 سيجما S6297 TL + التحفيز العازلة
MgSO 4 سيجما M2643 TL + التحفيز العازلة
كاسو 4 • 2H 2 O سيجما C3771 TL + التحفيز العازلة
D-غلوكوز سيجما G7528 TL + التحفيز العازلة
كبريتات الثاليوم الدريتش 204625 TL + التحفيز العازلة
HEPES سيجما H4034 TL + التحفيز العازلة
DMSO سيجما D4540 مذيب
ثماني قنوات إلكترونية pipettor Biohit E300 الطلاء الخلية في 384 -وحات جيدة
BD PureCoat أمين المغلفة 384 وحات جيدة BD العلوم البيولوجية 356719 مقايسة microplates
تأهل صدى حسنا البولي بروبلين 384 صفيحة ميكروسكوبية (384PP) Labcyte P-05525 microplates مجمع مصدر
microplates البولي بروبلين 384 جيد غرينر بيو واحد 781280
Multidrop موزع كومبي كاشف الحرارية العلمية 5840300
ELx405 صفيحة ميكروسكوبية غسالة بيوتيك ELx405HT غسل الخلايا الآلي
صدى معالج السائل Labcyte Labcyte صدى 550
برافو الآلي منصة تداول السائل اجيلنت تكنولوجيز نموذج قياسي
حمامةتسو FDSS 6000 هاماماتسو التصوير الحركي لوحة قارئ

الجدول 1. قائمة المواد والكواشف.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ehrlich, J. R. Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy. J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).
  2. Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. Small-molecule modulato....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Inward Rectifier Potassium ChannelsThallium Flux AssayHigh throughput ScreeningFluorescent Tl Reporter DyeFluoZin 2Tetracycline Inducible Cells384 Well PlateZ Prime CalculationFluorescence Plate ReaderSmall molecule Modulators

Related Articles