מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד

סיכום

השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.

תקציר

קרדיומיופתיה המורחבת (DCM) היא האחד הגורמים העיקריים לאי ספיקת לב במבוגרים הצעירים ^1. למרות נטייה גנטית וחשיפה לחומרים רעילים ידועות סיבות למחלה זו כבשליש מהחולים, מקורו של DCM נותר במידה רבה בלתי ברור. במספר לא מבוטל של חולים אלה, נוגדנים העצמיים נגד אפיטופים לב שכבר זוהה וחשודים לשחק תפקיד מרכזי בתחילת ההתקדמות של המחלה ^2,3. החשיבות של נוגדנים עצמיים לב מודגשת על ידי שיפור המודינאמית נצפה בחולי DCM נטרול נוגדנים עצמיים על ידי immunoadsorption ^3-5. מגוון רחב של אנטיגנים ספציפיים כבר זוהה ^2,3 ונוגדנים נגד יעדים אלה עשויים להיות מזוהים על ידי immunoassays. עם זאת, המבחנים הללו אינם יכולים להבחין בין הגירוי (ולכן פונקציונליים יעיל) וחסימת נוגדנים עצמיים. יש גובר evidence כי הבחנה זו היא חיוני ^6,7. כמו כן, ניתן להניח כי היעדים למספר נוגדני cardiotropic עדיין לא מזוהים ולכן אינו ניתן לגילוי על ידי immunoassays. לכן, הקים שיטה לגילוי נוגדנים תפקודיים פעילים cardiotropic, עצמאיים של אנטיגן החוקי. הרקע לשיטה הוא ההומולוגיה הגבוהה בדרך כלל נצפתה לאזורים פעילים של חלבונים בלב בין יונקים ^8,9. הדבר מצביע על כך נוגדני לב הופנו נגד אנטיגנים אנושיים יחצו-מגיבים עם תאי המטרה שאינם בני אדם, המאפשרים בדיקה של נוגדנים מחולי DCM על cardiomyocytes חולדות בוגרות. השיטה שלנו כוללת 3 שלבים: הראשון, IgG מבודד מפלזמת מטופל באמצעות נוגדני sepharose מצמידים אנטי IgG מתקבלים מעמודות immunoadsorption (PlasmaSelect, Teterow, גרמניה). cardiomyocytes שנית, למבוגרים מבודדים על ידי זלוף collagenase במנגנון זלוף Langendorff באמצעות aprotocol שונה מעבודות הקודמות של ^10,11. את cardiomyocytes מתקבל מצורפים לcoverglasses הקבורים laminin המצופה ומוכתם בFura-2, צבע פלואורסצנטי סידן סלקטיבית אשר יכולה להיות מובא בקלות לתוך התא כדי לבחון הסידן תוך תאי (Ca ^{2 +)} תוכן ^12. בשלב האחרון, ההשפעה של מטופל על IgG קיצור התא וCa ^{2 +} ארעי של cardiomyocytes שדה מגורה מנוטר באופן מקוון באמצעות מערכת ניטור התכווצות (IonOptix, מילטון, מסצ'וסטס, ארה"ב) סיד myocyte מסחרי ומחובר לניאון הפוך סטנדרטי מיקרוסקופ.

פרוטוקול

1. בידוד נוגדנים מדגימות מטופל

1. הכן עמודות המיני immunoadsorption ידי מילוי 3 מ"ל אנטי IgG sepharose לכל 2 מיליליטר מטופל EDTA פלזמה לעמודה ריקה Econo פאק. IgG בידוד דורש לפחות 2 מ"ל של פלזמת חולה.
2. הנח על גבי מסנן אנטי IgG sepharose, חתכת את הקצה התחתון של העמודה ולחץ על המסנן להגיע לקצב זרימה של כ 1 טיפה / שנייה. בואו פתרון השימור הנגמר של העמודה.
3. לשטוף את העמודה עם 3 כרכים 0.9% NaCl לנפח הפלזמה.

תוצאות

שתי דוגמאות למדידת inotropy הסלולרי בתחום מגורה cardiomyocytes הבוגר (איור 2) באמצעות myocyte Ca ⁺ ומערכת הקלטת contractility ² הם כדלקמן. איור 3 נותן רושם של מדידת שליטה, ואילו באיור 4 ההשפעה של נוגדני cardiodepressive של חולה עם DCM מוצג.

בשתי הדוגמות, קיצור תא ראשוני וCa ^{2 +} ארעיות במהלך superfusion עם EB תערוכת פסגות ברורות וק.......

דיון

השיטה הוצגה מציעה דרך מתאימה כדי לזהות נוגדנים עצמיים לבביים יעילים תפקודיים בחולים עם DCM ממוצא לא ברור. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל זיהוי של נוגדנים פעילים נגד פונקציונליים β1-adrenoceptor לפי חשיבותם ברמות cAMP ^6, השיטה שלנו אינה תלויה בepitope ספציפי. כמובן שיש מבחנים עצמאיים epitope אחרים שתוארו בספרות, כלומר לספור את הקצב הפועם של cardiomyocytes ילוד ^13, מדידת זרמי סידן בשריר לב במבוגרי טכניקת מהדק תיקון או ההתכווצות של סיבים מבודדים פו.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב / הציוד	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
פתרון Immunosorba שימור	Fresenius טיפול רפואי	903609211
סוג collagenase 2	מערכת תא	LS004176
BSA, חומצות שומן חופשי	סיגמה אולדריץ	A6003
Laminin	סיגמה אולדריץ	L2020
Fura-02:00	סיגמה אולדריץ	F0888	1 מ"ג / מ"ל ​​בDMSO
עמודות Econo פאק כרומטוגרפיה	BioRad	732-1010
ספקטרה / פור יוטק התאי אסתר דיאליזת Membranדואר	Spectrumlabs	131417
4 גם הקבורים Coverglass	Nunc	155383
סיד Myocyte ומערכת הקלטת contractility	IonOptix
תוכנת ניתוח IonWizard 6.0	IonOptix