Ottimizzazione iterativa di duplex di DNA per cristallizzazione di Seqa-DNA Complessi

Sommario

Struttura cristallina di proteine-DNA può fornire indicazioni in funzione della proteina, meccanismo, così come la natura dell'interazione specifica. Qui, segnaliamo come ottimizzare la lunghezza, la sequenza e le estremità del DNA duplex per la co-cristallizzazione con Escherichia coli Seqa, un regolatore negativo dell'inizio della replicazione.

Abstract

Escherichia coli Seqa è un regolatore negativo della replicazione del DNA che impedisce prematuri eventi reinitiation sequestrando cluster hemimethylated GATC entro l'origine di replicazione ^1. Al di là della provenienza, Seqa si trova a le forche di replicazione, dove organizza DNA appena replicato in un aumento delle strutture ordinate ^2. Associa Seqa solo debolmente con singole sequenze GATC, ma forma complessi ad alta affinità con duplex di DNA contenenti più siti GATC. L'unità minima funzionale e strutturale di Seqa è un dimero, spiegando così il requisito di almeno due sequenze GATC per formare un complesso ad alta affinità con DNA hemimethylated ^3. Inoltre, l'architettura Seqa, con l'oligomerizzazione e DNA-legame domini separati da un linker flessibile, consente il collegamento di ripetizioni GATC separati da un massimo di tre spire elicoidali. Pertanto, comprendere la funzione di Seqa a livello molecolare richiede strutturale analisi di Seqa legata a più sequenze GATC. In proteina-DNA cristallizzazione, DNA può avere nessuno ad un eccezionale effetto sulle interazioni di imballaggio a seconda delle dimensioni relative e l'architettura della proteina e del DNA. Se la proteina è più grande della DNA o impronte maggior parte del DNA, l'imballaggio cristallo è mediata principalmente da interazioni proteina-proteina. Viceversa, quando la proteina è la stessa dimensione o minore del DNA o copre solo una frazione delle interazioni DNA, DNA-DNA e DNA-proteina dominano imballaggio cristallo. Pertanto, la cristallizzazione della proteina-DNA complessi richiede lo screening sistematico di ⁴ DNA lunghezza e termina DNA (smussato o sporgenza) ^5-7. In questo rapporto, descriviamo come progettare, ottimizzare, purificare e cristallizzare duplex di DNA contenenti hemimethylated tandem ripete GATC in complesso con una variante dimerica di Seqa (SeqAΔ (41-59)-A25R) per ottenere cristalli adatti per la determinazione della struttura.

Protocollo

1. Protein Purification

Il linker flessibile che collega la N-(oligomerizzazione) e C-terminale (DNA binding) dominii Seqa aiuti riconoscimento dei hemimethylated ripetizioni GATC separate da 1-3 giri sul DNA. Per questo studio, abbiamo utilizzato una variante dimerica della Seqa (SeqAΔ (41-59)-A25R) con una mutazione puntiforme nel dominio N-terminale che impedisce l'ulteriore oligomerizzazione e un linker accorciata che limita legante il DNA a tandem GATC ripete separati esclusivamente un giro sul DNA (Figura 1) ^2,8.

1. Trasformare BL21 (DE3) con il plasmide codificante Seqa sotto il controllo del....

Discussione

Una delle maggiori sfide nel macromolecolare cristallografia a raggi X è l'ottenimento di cristalli di qualità di diffrazione. Nel caso di complessi proteici o proteine-DNA, questa sfida è aggravato a causa delle variabili aggiuntive che devono essere ottimizzati. Si crede che la lunghezza del DNA e la presenza di sbalzi appiccicose per migliorare associazione di molecole di DNA più vicini in un pseudo-duplex sono i principali parametri per ottimizzare. Tuttavia, abbiamo dimostrato che la natura e la lunghezza di qu.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Catalogo #	Commenti (opzionale)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Base Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glicerina	Caledon	5350-1
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Di sodio dodecil solfato (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% Bis 29:1 / acrilammide	Bio Base Inc.	A0007-500ml	Conservare a 4 ° C
Acido borico	EMD	BX0865-1
Xilene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Blu bromofenolo	Bioshop	BR0222
Doppio sistema di regolazione verticale Gel	CBC Scientific Company Inc.	DASG-250
Indice cristallizzazione schermo	Hampton ricerca	HR2-144	Conservare a 4 ° C
I cristallizzazione guidata schermo	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Conservare a 4 ° C
Wizard II cristallizzazione schermo	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Conservare a 4 ° C
Classics cristallizzazione schermo	Qiagen	130701	Conservare a 4 ° C
Intelliplate vassoi	Art Robbins Instruments	102-0001-00
			Soluzioni Proteine ​​tampone purificazione: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT e 5% glicerolo. Proteine ​​tampone di conservazione: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA e il 5% glicerolo. Gel mix caricamento: Aggiungere 20 g di saccarosio, 25 mg di blu di bromofenolo, 25 mg di xilene cyanol FF, 1 ml di 10% w / v SDS e 10 ml di TBE 10X a 70 ml di autoclavato DDH 2 O. Mescolare con blando riscaldamento fino al saccarosio è sciolto e regolare la finaleil volume a 100 ml con autoclavato DDH 2 O. Conservare a 4 ° C. Loading buffer 2X: Aggiungere 11 g di urea a 10 ml di miscela di gel loading. Mescolare su una piastra calda fino urea si scioglie. Aliquotare in 2 provette ml e conservare a 4 ° C. PAGINA 10 volte mix: Mix 420,4 g di urea, 100 ml di TBE 10X (autoclave), 250 ml di 40% 29:1 Bis / acrilammide in DDH 2 O. Mescolare fino a quando completamente sciolto e regolare il volume a 1 litro. Conservare in bottiglie scure a 4 ° C. TBE 10X: sciogliere 108 g di TRIS, 55 g di acido borico e 9,3 g di EDTA in 1 litro di DDH 2 O. Autoclave e conservare a temperatura ambiente. Tampone di eluizione: Diluire 8 ml di NaCl 5 M, 2 ml di 1 M Tris pH 7,5, 0,4 ml di 0,5 M EDTA pH 8 su 200 ml di DDH 2 O. Autoclave e conservare a temperatura ambiente.