$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Manduca sexta, широко известная как табачный роговой червь, считается значительным сельскохозяйственным вредителем, питающимся пасленовыми растениями, включая табак и помидоры. Восприимчивость личинок M. sexta к различным энтомопатогенным видам бактерий1-5, а также богатство доступной информации об иммунной системе насекомого6-8 и ожидаемой последовательности генома9 делают его хорошим модельным организмом для использования при изучении взаимодействий хозяина и микроба во время патогенеза. Кроме того, личинки M. sexta относительно крупные и их легко манипулировать и содержать в лаборатории по сравнению с другими восприимчивыми видами насекомых. Их большой размер также способствует эффективному извлечению ткани/гемолимфы для анализа реакции хозяина на инфекцию.
Представленный здесь метод описывает прямое введение бактерий в гемоцел (кровеносную полость) личинок M. sexta. Этот подход может быть использован для анализа и сравнения характеристик вирулентности различных видов бактерий, штаммов или мутантов путем простого мониторинга времени до смерти насекомых после инъекции. Этот метод был разработан для изучения патогенности видов Xenorhabdus и Photorhabdus, которые обычно ассоциируются с переносчиками нематод в качестве средства проникновения в насекомое. Энтомопатогенные нематоды обычно заражают личинки через естественные пищеварительные или дыхательные отверстия ивскоре после этого выделяют свое симбиотическое бактериальное содержимое в гемолимфу (кровь) насекомого. Описанный здесь метод инъекции позволяет обойти необходимость в переносчике нематоды, тем самым устраняя воздействие бактерий и нематоды на насекомое. Этот метод позволяет точно подсчитывать инфекционный материал (клетки или белок) в посевном материале, что невозможно при использовании других существующих методов анализа энтомопатогенеза, включая анализ на укус11 и анализ на пероральную токсичность12. Кроме того, пероральные анализы токсичности направлены на вирулентность секретируемых токсинов, вводимых в пищеварительную систему личинок, в то время как метод прямого введения направлен на вирулентность инокуляции цельных клеток.
Полезность метода прямой инъекции, описанного здесь, заключается в анализе бактериального патогенеза путем мониторинга смертности насекомых. Тем не менее, этот метод может быть легко расширен для использования в изучении влияния инфекции на иммунную систему M. sexta. Насекомое реагирует на инфекцию как гуморальными, так и клеточными реакциями. Гуморальная реакция включает распознавание бактериально-ассоциированных паттернов и последующую продукцию различных антимикробных пептидов7; экспрессия генов, кодирующих эти пептиды, может контролироваться после прямого инфицирования с помощью экстракции РНК и количественной ПЦР13. Клеточный ответ на инфекцию включает в себя узелковость, инкапсуляцию и фагоцитоз инфекционных агентов гемоцитами6. Чтобы проанализировать эти реакции, введенные насекомые могут быть препарированы и визуализированы с помощью микроскопии13, 14.