Метод, описанный здесь используется непосредственный впрыск энтомопатогенных бактерий в hemocoel из Manduca Sexta Личинками насекомых. M. Sexta Является коммерчески доступным и хорошо изученных насекомых. Таким образом, этот метод представляет собой простой подход к анализу хост-бактериальных взаимодействий с точки зрения одного или обоих партнеров.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Manduca sexta, широко известная как табачный бражник, считается серьезным сельскохозяйственным вредителем, питающимся пасленовыми растениями, включая табак и томат. Восприимчивость личинок M. sexta к различным видам энтомопатогенных бактерий1-5, а также большой объем доступной информации об иммунной системе этого насекомого6-8 и ожидаемая последовательность генома9 делают этот вид подходящим модельным организмом для изучения взаимодействий между хозяином и микробом в процессе патогенеза. Кроме того, личинки M. sexta относительно крупного размера, их легче манипулировать и содержать в лабораторных условиях по сравнению с другими восприимчивыми видами насекомых. Большой размер также облегчает эффективное извлечение тканей/гемолимфы для анализа ответа хозяина на инфекцию.
В данном методе описывается прямое введение бактерий в гемоцель (кровеносную полость) личинок M. sexta. Этот подход может быть использован для анализа и сравнения характеристик вирулентности различных видов бактерий, штаммов или мутантов путем простого мониторинга времени до гибели насекомого после инъекции. Метод был разработан для изучения патогенности видов Xenorhabdus и Photorhabdus, которые обычно ассоциируются с нематодами-переносчиками для проникновения в организм насекомого. Энтомопатогенные нематоды обычно заражают личинок через естественные пищеварительные или дыхательные отверстия, после чего вскоре высвобождают свои симбиотические бактерии в гемолимфу (кровь) насекомого10. Описанный здесь метод инъекции исключает необходимость в нематоде-переносчике, тем самым разделяя эффекты воздействия бактерий и нематод на насекомое. Данный метод позволяет точно подсчитать количество инфекционного материала (клеток или белка) в инокуляте, что невозможно при использовании других существующих методов анализа энтомопатогенеза, включая метод надреза (nicking)11 и тесты на пероральную токсичность12. Кроме того, тесты на пероральную токсичность позволяют оценить вирулентность секретируемых токсинов, введенных в пищеварительную систему личинок, тогда как метод прямой инъекции позволяет оценить вирулентность инокулятов из целых клеток.
Полезность метода прямого введения, описанного здесь, заключается в анализе бактериального патогенеза путем мониторинга смертности насекомых. Однако данный метод может быть легко расширен для изучения влияния инфекции на иммунную систему M. sexta. Насекомое реагирует на инфекцию посредством как гуморальных, так и клеточных ответов. Гуморальный ответ включает распознавание бактериальных паттернов и последующую выработку различных антимикробных пептидов7; экспрессию генов, кодирующих эти пептиды, можно отслеживать после прямого заражения с помощью экстракции РНК и количественной ПЦР13. Клеточный ответ на инфекцию включает нодуляцию, инкапсуляцию и фагоцитоз инфекционных агентов гемоцитами6. Для анализа этих реакций подвергнутых инъекции насекомых можно препарировать и исследовать с помощью микроскопии13, 14.
Протокол
1. Насекомое стерилизации яйцо и воспитания
- Подготовка диета по первой автоклавирования 15 г при условии, агар в 900-1000 мл H 2 O. Сразу же после автоклавирования, смешайте с 166 г пшеничного зародыша диеты и растушуйте в лаборатории блендере. Налейте в чашку (или блюд), чтобы охладиться, а затем перенести диету, чтобы алюминиевой фольги, плотно завернуть и хранить при 4 ° C.
- Прибыв на место, стерилизовать M. Sexta яйца с 250 мл 0,6% раствором хлорной извести в течение 2-3 мин в стакане держатель фильтра и устройства термос с 90 мм фильтровальной бумаги, периодически помешивая.
- Включите вакуум для слива раствором хл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представитель примере насекомых анализе смертности изображено на рисунке 3. В этом эксперименте, насекомые вводили около 50 колониеобразующих единиц (КОЕ) или дикого типа (ATCC19061) или ослабленного штамма мутанта (LRP 13) из Xenorhabdus nematophila выросла до середины логарифмической фазы (п = 6 насекомые каждого штамма). Насекомые наблюдались в течение примерно 72 часов, и процент насекомых вводят еще жива в каждой временной точке регистрируются. В этом случае ослабленног.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Непосредственный впрыск М. Sexta личинок с энтомопатогенных бактерий, как описано здесь, служит простым и эффективным средством для анализа бактериальной вирулентности. Этот метод также легко адаптируется для различных испытуемых и / или условий. Бактерии могут быть получены различными способами перед инъекцией. В случае X. nematophila, дикий тип клеток, выращенных в богатую питательными веществами Лурия-Bertani (LB) среды до середины логарифмической фазы, как правило, самой опасной, убивая все или поч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить прошлом члены Goodrich-Блэр лаборатории: Саманта Orchard, Kimberly Cowles, Эрин Герберт-Tran, Грега Ричардса, Меган Менар, и Youngjin парка за их вклад в развитие этого протокола. Эта работа финансировалась Национальным научным фондом грантов IOS-0950873 и Национального института здоровья АЯРБ общение FAI084441Z.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| 90 мм фильтровальная бумага | Ватман | 1001 090 | |
| Стеклянный держатель фильтра | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca Sexta яйца | Каролина биологического питания | 143880 | |
| Диета непарного шелкопряда + агар | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5,5 унции. пластиковые контейнеры и крышки | Компания Solo Cup | URC55-0090 PL4-0090 | |
| 1 унция. пластиковые контейнеры и крышки | DART Container Corporation | 100pc 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 мм NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na 2 HPO 4, 1,46 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4 | ||
| Шприц | Гамильтон | 80208 | 30 размера, 0,375 "длиной, точка стиль 2 |
Ссылки
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
