Immün yanıt ve davranış arasındaki bağlantıyı anlamak için, lokomotor davranışları ölçmek için bir yöntem tarif Drosophila Bakteriyel enfeksiyon yanı sıra izleme sağkalım, bakteri yükü, ve doğuştan gelen bağışıklık, NFKB önemli bir regülatör gerçek zamanlı aktivite ile bir bağışıklık yanıtı bağlamaya sinekler yeteneği sırasında.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü
Bu makalede
Özet
Özet
Immün yanıtı ve konak davranış arasında karmaşık bir etkileşim tür geniş bir biçimde tarif edilmiştir. Aşırı uyku, özellikle, memelilerde 1 enfeksiyonuna yanıt olarak oluştuğu bilinmektedir ve ayrıca son zamanlarda Drosophila melanogaster 2'de tarif edilmiştir. Bu, genel olarak uyku bir enfeksiyon sırasında ana için yararlı olan ve bir güçlü bağışıklık sistemi 3,4 korunması için önemli olduğu kabul edilir. Ancak, bu hipotezi destekleyen deneysel kanıtlar 4 sınırlıdır ve bir bağışıklık yanıtı sırasında aşırı uyku fonksiyonu belirsizdir. Biz bu karmaşık sorunu çözmek için multidisipliner bir yaklaşım kullanmış ve basit bir genetik model sistem, meyve sineği Drosophila melanogaster de çalışmalar yapmıştır. Biz, sinekler lokomotor davranışlar ve uyku ölçülmesi için bir standart tahlil kullanmak, ve bu tahlil sinekler infecte davranış ölçmek için nasıl kullanıldığını göstermekbir bakteri patojen d. Bu test aynı zamanda bir enfeksiyon sırasında bireysel sinekler sağkalım süresini izlemek için yararlıdır. Bağışıklık işlevi ek önlemler enfeksiyon ve NFKB, Drosophila doğal immün yanıtı için merkezi bir anahtar transkripsiyon faktörünün aktivasyonu temizlemek için sinekler yeteneğini içerir. Enfeksiyon sırasında sağkalım sonuçları ve bakteriyel klirense Hem birlikte direniş ve enfeksiyona hoşgörü göstergeleridir. Toleransı sistem 5 içinde patojen yüksek seviyelerde olmasına rağmen bir enfeksiyon hasarı sınırlamak ve böylece hayatta kalmak için ana yeteneği olarak tanımlanır iken Direniş, bir enfeksiyon temizlemek için sinekler yeteneğini ifade eder. Enfeksiyon sırasında NFKB faaliyet Gerçek zamanlı izleme enfeksiyon sırasında hayatta bir moleküler mekanizma fikir sağlar. Bu apaçık deneylerinde Drosophila kullanımı uyku genetik ve moleküler analizler kolaylaştırırve immün yanıt ve nasıl bu iki kompleks sistemlerin karşılıklı etkilenir.
Protokol
Bu protokol, bir bakteriyel enfeksiyona maruz kalan sinek toplandı dört farklı okuma elde etmek için iki düzeneklerinin (Şekil 1) kullanır. 2) sağkalım sonuçları;; 3) sinek bakteri yükü ve 4) in vivo NFKB muhabiri aktivitesinin gerçek zamanlı ölçümü Bu çıkışlar) uyku / uyanıklık davranışları 1 içerir. Drosophila mevcuttur genetik araçları ile birlikte, bu ölçümler bağışıklık fonksiyonu ve davranışı arasındaki moleküler bağlantıyı içine mekanistik bakış açısı sağlar.
1. Sinekler Tedbir Lokomotor Aktivite ve Uyku
- Lokomotor aktivitesini ölçmek ve Drosophila etkinliği izleme sistemi (DAM2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
- Enfeksiyon uyku teşvik. Bu örnekte, Canton-S (CS), vahşi tip sinekler ve bir NFKB gen, Relish (İ E20) 14 eksik mutant sinekleri, iki DAM2 aktivite monitörleri dolduruldu (n = her bir genotip için 32) ve yukarıda açıklandığı gibi enfekte. Sinekler davranış ve enfeksiyon 2,7,8 üzerinde sirkadiyen saat etkisini ortadan kaldırmak için sürekli ışık altında tutuldu. Daha önce anlatıldığı gibi 11 İ E20 mutant CS isogenized edildi. Sinekler Hem setleri S. ile enfek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol davranış, özellikle uyku, bağışıklık yanıtı parametreleri nasıl bağlantılı olduğuna araştırmak için bir yaklaşım belirlemektedir. Bu parametreler in vivo bir lusiferaz muhabir tarafından ölçülen bakteri yükü, sağkalım sonuçları ve NFKB aktivite içerir. Birlikte bu parametreler bir sinek bir enfeksiyonla mücadele ne kadar iyi hakkında bilgi sağlar. Bakteriyel yük ve sağkalım sonuçları Drosophila basit ölçümü dahil bağışıklık yanıtı parametrelerdir. Yenik hızla bakteriyel enfeksiyona bağışıkl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu eser hibe # IOS-1025627 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen ve hibe kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri # 1R21NS078582-01 tarafından ÇENE etmek edildi
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Malzeme Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Ekipman | |||
| İnkübatörler | Percival Scientific, Inc | I30BLLC8 I36VLC8 | Programlanmış ışık / sıcaklık programları çalıştıran herhangi inkübatör yeteneğine uygundur. |
| Drosophila Aktivite Monitörler | Trikinetics Inc, Waltham, MA | DAM2 | Başka 6 açıklandığı gibi, bu sistem bir bilgisayar arayüzü, yazılım ve diğer aksesuarları gerektirir. |
| Pyrex Cam Tüpler | Trikinetics Inc, Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Mikroplaka sintilasyon ve ışıldama sayacı | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 dedektör | Işıldama tespit etme yeteneğine sahip herhangi bir mikroplaka okuyucu haberci deneyi için bu tür de kullanılabilir. TopCount birden dedektörleri ve otomatik istifleyici içerir; birden plakaları sürekli okumak için programlanmış olma yeteneğine sahiptir. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Bakteri kültürlerinin Görüntüleme isteğe bağlıdır; görsel ışık kapasitesi ile herhangi bir dijital görüntüleme sistemi yeterlidir. | |
| Mikropipet Çektirme | TriTech Research, Inc | Narishige PC-10 | |
| Malzemeleri | |||
| Borosilikat Cam Kapilerde | Dünya Precision Enstrüman A.Ş. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Şırınga | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Şırınga İğneler | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - tüp zarar görmesini önlemek için iğne ucu kesilir. |
| Silikon Hortum, id (0.030 ") od (0.065") Duvar Kalınlığı (0.018 ") | VWR | 60985-706 | Bir şırınga cam kılcal iğne takmak için kullanılır |
| 3 Yollu Musluk | Amerikan Pharmaseal Şirketi | K75 | |
| Kontes Pelet Pestle Akülü Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pelet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Cam bilyalar 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Mikroplaka Microlite 1 + | Thermo Scientific | 7571 | Select ışıldama için uygun olan levha 96-kuyu - onlar opak olması gerekir. |
| Topseal'ın-A :96-iyi mikropleytin | Perkin Elmer | 6005185 | Mikroplaka Basın-On Yapıştırıcı Sızdırmazlık Film |
| D-lusiferin, potasyum tuzu | Altın Biyoteknoloji, Inc | LUCNA | |
| Yazılım | |||
| Insomniac2 | Yazarlara istek üzerine mevcuttur | özel; Lesley Ashmore, Ph.D. tarafından yazılmış (Westminster College) | Uyku 2,6,11 analizi için rutin kullanılır olmuştur Matlab tabanlı yazılım |
| Drosonex | Yazarlara istek üzerine mevcuttur | özel; Thomas Coradetti (Kaldırım Yazılımı) tarafından yazılmış | Ham veri dosyaları hayatta kalma analizi için kullanılan bir bilgisayar programı MSVC6 ile toplanmışTrikinetics sistemi |
| Photoshop CS3 | Kerpiç | Dijital görüntüler (isteğe bağlı) kob / plaka numaralarını almak için Faydalı |
Kaynaklar
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
