השיטה מתוארת בידוד ואפיון של תאי גזע אנושיים שיניים זולות (hDPSCs) באמצעות אחת דיסוציאציה האנזימטית של עיסה (DPSC-ED) או תולדה ישירה של תאי גזע מרקמת explants עיסה (DPSC-OG). לאחר מכן על ידי במבחנה בידול השוואתי של שני סוגי hDPSCs לodontoblasts.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות
במאמר זה
סיכום
מבוא
תאי גזע הם תאי clonogenic אשר מחזיקים שתי תכונות יוצאות דופן, הידועים כ- עצמה רבה והתחדשות עצמית 15. בין כל תאי גזע עם פוטנציות replicative שונות, תאי גזע שיניים כתאי גזע לאחר הלידה יכולים לעורר תשומת לב בשנים האחרונות בגלל הנגישות שלהם, הפלסטיות, ויכולת שגשוג גבוהה בהשוואה לתאי גזע בוגרים אחרים 16. אופייני, בדומה לתאי גזע mesenchymal, תאי גזע הם תאי עיסת שיני clonogenic חסיד שבו יש יכולת המרובה בידול לmesenchyme ו / או שושלות אינן mesenchyme, היא במבחנת in vivo. 1-8,17,18 DPSCs מזוהים על ידי הביטוי שלהם השלילי של אנטיגנים hematopoietic (למשל, CD45, CD34, CD14), וביטוי חיובי של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכן את פתרון אנזימים ובינוני הפצה (PM)
- הפוך סוג collagenase פתרון: תשקול את collagenase סוגי (12 מ"ג / מ"ל) ולהתמוסס במ"ל PBS 1 ומסנן באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. ואז למקם אותו צינור מ"ל 15 ולשמור אותו ב -20 ° C עד צורך.
- הפוך פתרון dispase: תשקול את dispase (16 מ"ג / מ"ל) ולהתמוסס ב1 המ"ל PBS וסינון באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. ואז למקם אותו צינור מ"ל 15 ולשמור אותו ב 4 ° C עד צורך.
- הפוך פת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
- DPSCs שהתקבלו על ידי ניתוק האנזימטית (DPSC-ED) מוצגות כאן ביום 10, 15,18 (איור 1). המושבות יזמו להיוצר על כמעט 3 עד 5 ימים לאחר הבידוד.
- DPSCs outgrown (DPSC-OG) מוצג באיור 2 ביום 5, 10, 13 & 18. פיברובלסטים דמויי תאים החלו להגר מרקמות עיסה לתוך הבקבוק על ידי הזמנה מקביל על ידי כמעט 5 ימים לאחר זריעה.
- DPSCs במעבר 3.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר את התהליך של בידוד ואפיון של hDPSCs מעיסת שיניים באמצעות שתי שיטות, דיסוציאציה האנזימטית ותולדה ישירה של תאי גזע מרקמת explants עיסה. בנוסף, בבידול במבחנה של תאים אלו לתוך odontoblasts, הוערך על ידי assay & S QPCR כמותית אליזרין האדום.
פרוטוקולים קיימים לבידוד רקמת מוך משן האנושית היו בשימוש מכשירים שונים כגון מלקחיים (מלקחי עצם) 9, 29 עיקור מחט, גרייסי 30 מגרד,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
אנו מכירים תודה ד"ר ליילה Shakeri & ד"ר עארף Dournaei לדיסקוסם הקריטי ומר מוחמד רזא Khadem שריף לתומך הטכני שלו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | קטלוג או לוט. מספר | תגובות (אופציונלי) |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase סוגי | סיגמה אולדריץ | C0130-100 מ"ג | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| פניצילין / סטרפטומיצין | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| עוברי שור בסרום מוגדר (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| חומצה אסקורבית L-2-פוספט | סיגמא | A8960-5G | |
| L-גלוטמין | GIBCO | 25030-024 | |
| דקסאמתאזון | סיגמא | D4902 | |
| מימה β-גליצרול פוספט disodium מלח, BioUltra | סיגמא | G9422-100G | |
| אשלגן זרח monobasic | סיגמה אולדריץ | P5655 | |
| Osteogenesis Assay קיט | Millipore | PS01802031 | |
| עכבר IgG2b-PE אלוטיפ שליטה | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC עכבר IgG2b אלוטיפ שליטה | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC העכבר IgG1 κ אלוטיפ | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC / PE העכבר אנטי אנושי CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| CD146 PE אנטי אנושי | BD pharmingen | 550315 | |
| אנטי אנושי חד שבטי העכבר CD90/FITC | דקה | 00034418 | |
| CD73 PE עכבר אנטי אנושי | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| CD11b/Mac1 PE עכבר אנטי אנושי | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE עכבר אנטי אנושי | BD pharmingen | 555479 | |
| פתרון חיץ פוספט (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| מסננת תא 70-מיקרומטר | בז | 352360 | |
| 0.2 מיקרומטר מזרק מסנן | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 בקבוק התרבות 2 סנטימטר | סיגמה אולדריץ | Z707481 | |
| ציוד | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate ספקטרופוטומטר | Thermo מדעי | 51119200 | |
| מיקרוסקופ Fleurcense | אולימפוס | ||
| גרסת תוכנת 2.3.1 זורם |
מקורות
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce n....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
