تشريح والثقافة، وتحليل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأنسجة الجنينية الشبكية

ملخص

القيطم المورق يوفر نظام نموذجا مثاليا لدراسة الخلية مواصفات مصير وظيفة فسيولوجية لخلايا شبكية العين الفردية في الثقافة الخلية الأولية. هنا نقدم تقنية لتشريح الأنسجة الشبكية وتوليد الثقافات الخلية الأولية التي يتم تصويرها للنشاط الكالسيوم وتحليلها بواسطة التهجين في الموقع.

الملخص

العملية التي من خلالها المنطقة الأمامية من لوحة تثير العصبية في الشبكية الفقارية لا يزال يشكل محورا رئيسيا من البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. بالإضافة إلى أهمية واضحة الطبية لفهم وعلاج مرض الشبكية، وتطوير شبكية العين الفقارية تواصل لتكون بمثابة نظام نموذجا هاما وأنيقة لفهم الخلية العصبية والتمايز تقرير نوع ^1-16. العصبية في الشبكية تتكون من ستة أنواع الخلايا المنفصلة (العقدة، مبصرات عديم الاستطالات، الأفقي، وخلايا القطبين، والخلايا الدبقية مولر) مرتبة في طبقات النمطية، وهو النمط الذي يتم حفظها بشكل كبير بين جميع الفقاريات ^12،14-18.

أثناء الدراسة في الشبكية سليمة في الجنين النامية هو مطلوب بوضوح لفهم كيفية تطور هذا الجهاز المعقد من بروز الدماغ الأمامي في هيكل الطبقات، وهناك العديد من الأسئلة التي تفيد جيئة وذهابام توظيف النهج باستخدام زراعة الخلايا الأولية من خلايا الشبكية المفترض ^7،19-23. على سبيل المثال، وتحليل الخلايا من الأنسجة وإزالة فصلها في مراحل مختلفة يسمح احد لتبين حالة تحديد الخلايا الفردية في مراحل نمو مختلفة، وهذا هو، مصير الخلايا في غياب التفاعل مع الأنسجة المجاورة ^{8،19-22 ،24-33.} زراعة الخلايا الأولية كما يسمح المحقق لعلاج الثقافة مع الكواشف محددة وتحليل النتائج على مستوى خلية واحدة ^{5،8،21،24،27-30،33-39.} القيطم المورق، ونظام النموذج التقليدي لدراسة التنمية في وقت مبكر العصبية ^{19،27،29،31-32،40-42،} بمثابة مناسبة خاصة لنظام الشبكية زراعة الخلايا الأولية ^{10،38،43-45.}

الأنسجة الشبكية الافتراضي يمكن الوصول إليها من المراحل الأولى من التنمية، مباشرة بعد تحريض العصبية ^25،38،43. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا عشرفي كل خلية في الجنين يحتوي على توريد صفار، يمكن زرعها في خلايا شبكية العين وسائل الإعلام تعريف بسيط جدا يتكون من محلول ملحي مخزنة، وبالتالي إزالة آثار الخلط من الحضانة أو غيرها من المنتجات القائمة على الأمصال ^{10،24،44-45} .

ومع ذلك، فإن عزل الأنسجة الشبكية من الأنسجة المحيطة والمعالجة اللاحقة يمثل تحديا. هنا، نقدم طريقة لتشريح وتفكك خلايا الشبكية في المورق القيطم التي سيتم استخدامها لإعداد الثقافات الخلية الأولية التي من شأنها، في المقابل، يتم تحليلها لنشاط الكالسيوم والتعبير الجيني في الخلايا القرار واحد. في حين أن الموضوع المقدمة في هذه الورقة هو تحليل الكالسيوم العابرين عفوية، والتقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة واسعة من الأسئلة البحثية والنهج (الشكل 1).

البروتوكول

يتم تنفيذ جميع التجارب التالية البروتوكولات التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام في كلية وليام وماري. مراحل نمو المشار إليها في هذا البروتوكول، وفقا لفابر وNieuwkoop ^46.

1. تشريح

1. السماح للخلية ثقافة المتوسط ​​والمتوسطة الكالسيوم المغنيسيوم مجاني (CMF) لتتوازن إلى درجة حرارة الغرفة. سوف تحتاج أيضا ل0.1X مارك معدلة رينغر (MMR) 7،4-7،6 درجة الحموضة.
2. تعقيم العناصر التالية عن طريق تطبيق ضوء الأشع....

النتائج

وترد أمثلة على الحويصلات البصرية تشريح بنجاح (المرحلة 25) والشبكية (المرحلة 35) في أرقام 2E و2J. في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول في مراحل مختلفة من التنمية، فإن من الأهمية بمكان الحصول على الأنسجة الشبكية فقط لضمان الدقة لتجارب أخرى. إزالة بعناية البشرة في جميع مراحل والتأكد من أن لديك ملقط لا ثقب الأنسجة الشبكية. في المرحلة 35 أو أقدم، ويمكن أن ينظر إلى عدسة كطبقة واضحة على الجزء العلوي من شبكية العين ويمكن إزالتها عن طريق تجريف الحذر باستخدام ملقط.

المناقشة

مع أنواعه الخلية جيدا أن تتميز من الحفظ في جميع الفقاريات، وشبكية العين يوفر نموذجا مفيدا لدراسة العمليات الجزيئية الخلوية التي تنظم خلية مواصفات نوع والتمايز. زراعة الخلايا الأولية تتيح وسيلة قوية للتحقيق في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك التعبير الجيني، وديناميات البروتين، والكالسيوم والنشاط الكهربائي على مستوى القرار خلية واحدة. يمكن هنا نقدم تقنية بسيطة لزراعة الخلايا الأولية من الأنسجة تشريح الشبكية المفترض في القيطم المورق، كائن قابلة لمثل هذه الدراسات لا سيما .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم
			لتشريح والتثقيف
BD الصقر الأنسجة أطباق سهلة قبضة الثقافة، 35 مم	الصياد	08-772A
المتاح أطباق بتري البوليستيرين، 60 × 15 مم	الصياد	0875713A
35 مم السطح Nunclon أطباق بتري (مع Airvent)	الصياد	12-565-91
دومون الجميلة الملقط (Dumostar # 55)	الصياد	NC9341917
Cellattice الصغرى، حكمت ساترة من البلاستيك، 25 مم	الصياد	50-313-17
إيثيل-M-أمينوبنزوات Methanesulfonate الملح (MS-222)	MP Biomedicals، LLC	103106
جنتاميسين سلفات	انزو العلوم الحياتية	380-003-G025
Gibco التربسين (1:250) مسحوق	الحياة تكنولوجيز	27250-018
كولاجيناز نسج كلوستريديوم B من	روش	11088831001
البنسلين الستربتوميسين	Gibco	15140-122
النيل الأزرق كبريتات (اختياري)	Pfaltz وباور	N05550
500 مل زجاجة فراغ نظام تصفية / التخزين، 0.22 ميكرومتر مسام غشاء 33،2 سم CN ​​2	كورنينج	430758
			لتصوير الكالسيوم
فلوو-4 AM 1 ملم في DMSO الحل، خلية الدائم	الحياة تكنولوجيز	F-14217
الحل بلورونيك F-127 10٪ في المياه	الحياة تكنولوجيز	P-6866
LSM 510 نظام مجهر متحد البؤر	زايس	نموذج وقف العمل
منع الكاشف	روش	11096176001
			نيون لفي الموقع التهجين (FISH)
مكافحة Digoxigenin-POD، شظايا فاب	روش	11207733910
مكافحة DNP-HRP جسم	بيركن إلمر-	NEL747A
Cy3NHS استر	GE للرعاية الصحية	PA13101
NHS-فلوريسئين	الحرارية العلمية	46409
الفورماميد، منزوع الأيونات	Amresco	0606-950ML
المستخفية RNA، نوع IX	سيغما الدريخ	R3629
الهيبارين ملح الصوديوم، من مخاطية الأمعاء لحم الخنزير	سيغما الدريخ	H3393-250KU
CHAPS	سيغما الدريخ	C3023
			الجدول 2. الكواشف محددة والمعدات.
			حل مرجع محتويات خلية مستنبت تشانغ وسبيتزر، 2009 54 116 مم كلوريد الصوديوم 0،67 ملي بوكل 2 مم CaCl 2 1.31 مم MgSO 4 4.6 ملم تريس 1٪ (V: V) البنسلين / الستربتوميسين ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 مع حمض الهيدروكلوريك. تصفية تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرومتر CN 0.22. تخزين في C. ° 4 الكالسيوم والمغنيسيوم مجاني متوسطة (CMF) غو وآخرون، 1994 42؛. قو وسبيتزر، 1995 55 116 مم كلوريد الصوديوم 0،67 ملي بوكل 4.6 ملم تريس 0.4 ملم EDTA 1٪ (V: V) البنسلين / الستربتوميسين ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 مع حمض الهيدروكلوريك. تصفية تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرومتر CN 0.22. تخزين في C. ° 4 المالئيك حمض العازلة (MAB) SIVE وآخرون، 2000 53 100 ملم حمض المالئيك 150 مم كلوريد الصوديوم (7.5 درجة الحموضة). مارك لقارعو الأجراس معدلة (MMR)، 10X SIVE وآخرون، 2000 53 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ملي بوكل 1 ملم MgSO 4 2 مم CaCl 2 5 ملي HEPES درجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم 0.1X MMR يحتوي أيضا على 50 ملغ / مل يتم ضبط جنتاميسين سلفات ودرجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. MEMFA الحل، 10X SIVE وآخرون، 2000 53 0،1 M اجتماعات الأطراف (PH 7.4) 2 مم EGTA 1 ملم MgSO 4 3.7٪ الفورمالديهايد A حل 10X، دون الفورمالديهايد، يمكن تخزينها في C. ° 4 يضاف الفورمالديهايد جديدة (1/10 من حجم المخزون القياسي 37٪). في الموقع التهجين العازلة SIVه آخرون، 2000 53 50٪ الفورماميد 5X SSC 1 ملغ / مل RNA المستخفية 100 ملغ / مل الهيبارين 1X Denhart في الحل 0.1٪ توين 20 0.1٪ CHAPS 10 ملي EDTA. حلول. * يستخدم جنتاميسين، والمضادات الحيوية، في حين لدينا حلول MMR يتم استخدام البنسلين والستربتوميسين في وسائل الإعلام ثقافتنا.