凝血酶处理与对照人肺微血管内皮细胞转录组的RNA-seq分析

摘要

本方案介绍了一种完整且详细的操作流程，应用RNA测序（RNA-seq）这一强大的下一代DNA测序技术，对经或未经凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞转录组进行分析。该方案可推广应用于受不同试剂或疾病状态影响的多种细胞或组织。

摘要

通过检测细胞中mRNA水平来表征基因表达，是研究外部信号如何影响细胞转录机制的有效工具例如 药物处理）或细胞在健康状态与疾病状态之间的差异。随着下一代DNA测序技术的出现及其持续优化，RNA测序（RNA-seq）已成为转录组分析中日益常用的方法，可用于系统鉴定所有类型的转录本，确定所有表达基因的转录结构，并量化特定细胞、组织或生物体内全部转录本表达水平的动态变化^1,2 RNA-seq 正逐渐取代 DNA 微阵列，成为转录组分析的首选方法，因为它具有能够全面分析完整转录组、提供数字型数据（任意转录本的拷贝数）以及不依赖于任何已知基因组序列的优势。³.

本文介绍了一种完整且详细的RNA-seq实验方案，用于分析人肺微血管内皮细胞在有或无凝血酶处理条件下的转录组。该方案基于我们近期发表的研究《RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin》⁴，在该研究中，我们首次成功利用RNA-seq技术对经凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞进行了全面的转录组分析。本研究为深入探索凝血酶介导的内皮功能障碍在炎症性疾病、癌症、糖尿病及冠心病发病机制中的分子机制提供了前所未有的资源，并为这些疾病的治疗靶点发现提供了潜在的新方向。

本实验方案的描述性内容分为四个部分。第一部分描述了人肺微血管内皮细胞经凝血酶处理后的RNA提取、质量分析及定量方法。第二部分描述了文库构建与测序过程。第三部分描述了数据分析流程。第四部分描述了RT-PCR验证实验。文中展示了多个关键步骤的代表性结果。讨论部分提供了有助于提高关键步骤成功率的实用建议或注意事项。尽管本方案采用经凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞，但该方法可推广应用于经不同刺激物或抑制剂处理的哺乳动物及非哺乳动物细胞和组织的转录组分析，也可用于健康状态与疾病状态下细胞或组织转录组的比较研究。

方案

该方案的流程图如图1所示。

1. 凝血酶处理细胞、RNA 提取、RNA 质量评估与定量

1. 在6孔板中，使用含5%胎牛血清（FBS）、生长因子和抗生素的EGM-2培养基（Lonza，货号 CC-3202），将人肺微血管内皮细胞（HMVEC-LBl）培养至90–100%融合度。
2. 在给予凝血酶处理前30分钟，更换为无血清的饥饿培养基。
3. 在37 °C、5% CO₂条件下，用0.05 U/ml凝血酶处理细胞，或不加凝血酶作为对照，处理6小时。
4. 根据生产商说明书，使用Ambion mirVana试剂盒从处理组和对照组细胞中提取总RNA。
5. 按照Experion全自动电泳系统（www.bio-rad.com）的标准操作流程，使用Experion StdSense真核RNA芯片评估RNA质量。
6. 采用标准分光光度法对RNA进行定量。

2. 文库构建与测序

1. 每份样品使用 1 μg 高质量的总 RNA 作为起始材料。
2. 为构建文库，请遵循Illumina的标准操作流程（Illumina 说明书 # ....

结果

对于步骤1： 28S:18S比值传统上被用作RNA降解程度的指标。理想情况下，28S峰的面积应约为18S条带的两倍（比值为2），但在实际中往往难以达到这一理想比值。此外，通过分光光度法测得的28S:18S比值可能低估RNA的实际降解程度。为了更准确地量化RNA降解情况，从而评估RNA样本的质量，Experion系统会计算一个RNA质量指数（RQI）数值。RQI算法将RNA样本的电泳图谱与一系列标准化的、已知降解程度的RNA样本数据进行比较，自动输出一个介于10（完整RNA）到1（严重降解RNA）之间的评分。RNA样本的质量应至少达到RQI 7，理想情况下应高于8。 图2 展示了使用高质量RNA样本（RQI为8.4）所获得的Experion检测结果。

对于步骤2： 文库应在约250-300 bp处出现一条宽而明显的条带。图3展示了高质量文库的Experion检测结果。图4展示了标准曲线样品及一个未知样品（以深蓝色显示.......

讨论

关键步骤

RNA 操作：RNase 会降解即使是最高质量的 RNA，因此在 RNA 的分离、储存和使用过程中必须格外小心¹⁰。操作时应始终佩戴手套，以防止手部携带的 RNase 造成污染。应频繁更换手套，尤其是在接触皮肤、门把手或其他常见表面之后。应专用一套移液器用于 RNA 相关操作，且所有吸头和离心管均须为无 RNase 产品。RNA 的提取及后续应用应在人员流动较少的区域进行，并定期使用如 RNase-Zap 等去污产品对环境进行清洁。反复冻融也会导致 RNA 降解。为尽量减少此类情况，建议在 RNA 提取完成后立即分装，用于后续实验。或者，也可在提取后直接合成 cDNA，用于如 qRT-PCR 等下游应用。RNA 应储存于 -80 °C，并在使用过程中置于冰上。在使用前及使用过程中，应确保 RNA 样品充分解冻并充分涡旋混匀。

RNA的起始质量对于本实验方案的成功至关重要。使用降解或质量较差的RNA可能导致文库构建失败，或产生不足以用于测序的低产量。即使能够从降解或低质.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人肺微血管内皮细胞	Lonza	CC-2815
Lonza Bullet 培养基试剂盒	Lonza	CC-3202	包含 EGM-2、胎牛血清（FBS）、生长因子和抗生素
凝血酶（Thrombin）	Sigma	T4393
Ambion mirVana 试剂盒	Life Technologies	AM 1560
RNA酶清除剂（RNase-Zap）	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens RNA 试剂	Bio-Rad	700-7103
TruSeq RNA 文库构建试剂盒	Illumina	FC-122-1001
AMPureXP 磁珠	Beckman Coulter	A63881
Superscript 逆转录酶 II	Life Technologies	18064-014
Experion DNA 1K 试剂	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SybrGreen 荧光定量试剂	Qiagen	204163
PE 簇生成试剂盒	Illumina	PE-401-3001
PhiX 控制试剂盒	Illumina	FC110-301
200 循环 SBS 试剂盒	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ*	Illumina	SY-103-2001
cBot	Illumina	SY-301-2002
qPCR 仪 - Viia7	Life Technologies	型号 #VIIA7 / 设备编号 #10631261	或同等设备
Experion 系统	Bio-Rad	7007001	Bioanalyzer 为可替代系统
分光光度计	Bio-Tek	Epoch 微孔板分光光度计	或同等设备
离心机 - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	或同等设备
磁力架	Life Technologies	AM10027
96 孔 PCR 仪	通用实验室供应商
表 3. 关键试剂与主要设备清单。* 在视频中演示的是 HiSeq1000，而非 HiScanSQ。