По теги внеклеточных доменов мембранных рецепторов с superecliptic pHluorin, и эти изображения слияния рецепторов в культуре нейронов мыши, мы можем напрямую визуализировать отдельные везикулярного события вставки рецепторы клеточной мембраны. Эта техника будет играть важную роль в выяснении молекулярных механизмов, регулирующих рецепторов вставки в плазматическую мембрану.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Для более глубокого понимания механизмов, регулирующих трафик рецепторов между плазматической мембраной (ПМ) и внутриклеточными компартментами, требуется экспериментальный подход с отличным пространственным и временным разрешением. Более того, такой подход должен обладать способностью отличать рецепторы, локализованные на ПМ, от рецепторов во внутриклеточных компартментах. Что еще более важно, детектирование рецепторов в одной везикуле требует исключительной чувствительности, поскольку каждая везикула несет лишь небольшое количество рецепторов. Стандартные подходы к изучению трафика рецепторов включают поверхностное биотинилирование с последующим биохимическим детектированием, которому не хватает как необходимого пространственного, так и временного разрешения, а также исследование иммуномеченных поверхностных рецепторов с помощью флуоресцентной микроскопии, что требует химической фиксации клеток и, следовательно, не обладает достаточным временным разрешением1-6. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы и другие исследователи разработали и применили новую стратегию, позволяющую визуализировать динамическое встраивание рецепторов в ПМ с отличным пространственным и временным разрешением7-17. Этот подход включает в себя слияние pH-чувствительного GFP, superecliptic pHluorin 18, с N-концевым внеклеточным доменом рецепторов. Superecliptic pHluorin обладает уникальным свойством быть флуоресцентным при нейтральном pH и нефлуоресцентным при кислом pH (pH < 6.0). Таким образом, меченые рецепторы не флуоресцируют, находясь в кислом просвете внутриклеточных транспортных везикул или эндосомных компартментов, и становятся легко визуализируемыми только при воздействии нейтральной внеклеточной среды на внешней поверхности ПМ. Следовательно, наша стратегия позволяет нам отличать рецепторы на поверхности ПМ от рецепторов внутри внутриклеточных транспортных везикул. Для достижения достаточного пространственного и временного разрешения, а также чувствительности, необходимой для изучения динамического трафика рецепторов, мы использовали флуоресцентную микроскопию общего внутреннего отражения (TIRFM), которая позволила нам достичь оптимального пространственного разрешения оптического изображения (~170 nm), временного разрешения видеомикроскопии (30 frames/sec) и чувствительности, достаточной для детектирования флуоресценции одной молекулы GFP. Визуализируя рецепторы, меченные pHluorin, с помощью TIRFM, мы смогли напрямую наблюдать отдельные события встраивания рецепторов в ПМ в культивируемых нейронах. Этот метод визуализации потенциально может быть применен к любому мембранному белку с внеклеточным доменом, который может быть помечен superecliptic pHluorin, и позволит детально изучить ключевые механизмы встраивания различных мембранных белков (рецепторов, ионных каналов, транспортеров и т. д.) в ПМ.
Протокол
1. Подготовка культуры мышь Glia для нейронов принадлежности культуры
- T75 колбы покрыты раствора коллагена (1:3 разбавление Purecol в DDH 2 O). Колбы устанавливаются вертикально и оставили на ночь сушиться в капюшоне культуры ткани.
- Препарирование буфера (ACSF: 119 мм NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 30 мМ глюкозы, 25 мМ HEPES, рН 7,4, без кальция) и глии средств массовой информации (DMEM с добавлением 10% FBS, 10 ед / мл пенициллина, 10 мкг / мл стрептомицина и Glutamax) готовят и хранят при 4 ° С до готовности к употреблению.
- В день глии культуры, средств массовой информации глии нагревают в течение 30 мин при 37 ° С....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
По неизвестным причинам, мыши нейроны всегда сложнее, чем крысы культуре нейронов. По нашему опыту, смешанной культуре нейронов и глии хорошо работает для первичной культуре нейронов мыши. Однако такая смешанная культура не подходят для экспериментов TIRF изображений, так как в этом типе культуры нейронов и их процессы имеют тенденцию к росту на вершине глиальных клеток, располагающий нейронов somata и дендритные процессы вне досягаемости микроскопии TIRF. Таким образом, нижняя плотность нейронов культуры с несколькими .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа поддерживается запуск средств из лаборатории Джексона.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента О компании Номер по каталогу Комментарии | |||
| Очищенного бычьего коллагена решение (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Сбалансированный Хэнка солевой раствор (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| Пенициллина-стрептомицина (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| Пируват натрия | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM с высоким содержанием глюкозы | GIBCO | 10313-021 | |
| Фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) | |||
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Папаином | Уортингтон Биохимические корпорации | LS003126 | |
| Дезоксирибонуклеазы я из бычьей поджелудочной железы (ДНКазы I) | SIGMA | DN25-10мг | |
| Дульбекко буферном растворе (DPBS) | GIBCO | 14190-144 | |
| 0,05% трипсина | GIBCO | 25300-054 | |
| Поли-L-лизин гидробромид | SIGMA | P2636-1G | |
| Борной кислоты | Fisher-научным | BP 168-500 | |
| Neurobasal Средний | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Сыворотка-Free дополнения | GIBCO | 17504-044 | |
| Тепла неактивных лошадиной сыворотки | GIBCO | 26050-070 | |
| Липофектамина 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-научным | BP310-500 | |
| Культура Insert | Millipore | PICM03050 |
Ссылки
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and syn....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
