Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de primaire visuele cortex van de niet-knaagdier zoogdieren, worden neuronen geclusterd op basis van hun voorkeur voor stimuli functies zoals oriëntatie 1-4, richting 5-7, oculaire dominantie 8,9 en binoculaire dispariteit 9. Oriëntatie selectiviteit is de meest bestudeerde functie en een doorlopende kaart met een quasi-periodieke lay-out voor de gewenste oriëntatie aanwezig is in de gehele primaire visuele cortex 10,11. Integratie van de synaptische, cellulaire en netwerk bijdragen die leiden tot stimulans selectieve reacties in deze functionele kaarten vereist de hybridisatie van beeldvormende technieken die sub-micron overspannen millimeter ruimtelijke schalen. Bij conventionele intrinsieke signaal optische, kan de algemene indeling van functionele kaarten over het gehele oppervlak van de visuele cortex bepaald 12. De ontwikkeling van in vivo twee-foton microscopie met calcium gevoelige kleurstoffen laat toe bepalen synaptic-ingang te komen tot individuele dendritische spines 13 of een recordaantal activiteiten tegelijkertijd uit honderden individuele neuronale cellichamen 6,14. Bijgevolg combineert intrinsieke signaal beeldvorming met de sub-micron ruimtelijke resolutie van twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid om een precies welke dendritische cellen segmenten en bijdragen aan de micro-domein van elke functionele kaart in de neocortex. Hier laten we zien een hoge opbrengst methode voor het snel verkrijgen van een corticale oriëntatie kaart en tot een specifieke micro-domein in deze functionele kaart voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in een niet-knaagdier zoogdier. Met dezelfde microscoop gebruikt voor twee-foton beeldvorming, maken we eerst een oriëntatie kaart met behulp van intrinsieke signaal optische beeldvorming. Vervolgens laten we zien hoe je een micro-domein van belang het gebruik van een micropipet geladen met kleurstof om ofwel label richten op een bevolking van neuronale cellichamen of label van een enkel neuron zodanig dat dendrieten, stekels en axonen zijn zichtbaar invivo. Onze verfijningen ten opzichte van eerdere methoden vergemakkelijken onderzoek van neuronale structuur-functie relaties met subcellulaire resolutie in het kader van neocorticale functionele architecturen.
Protocol
1. Chirurgische Voorbereiding
- Laten anesthesie en permanent toezicht op de hartslag, eindigen getijden CO 2, EEG, en de temperatuur. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Medische Universiteit van South Carolina en waren gebaseerd op die we eerder gepubliceerde 9,15.
- Maak de dorsale oppervlak van de schedel door het snijden van de huid met een scalpel. Prepareer het bindweefsel bovenop het bot met behulp van een Brudon curette. Reinig het bot met behulp van katoen getipt applicators en een gaasje. Breng bot was (indien nodig) naar de schedel, af en toe bloeden te stoppe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de precisie van onze dye labeling methoden illustreren, gericht op de kleinste micro-domein van elke bekende functionele kaart in de knaagdieren neocortex. Dun doorspekt het hele oriëntatie kaart in de primaire visuele cortex zijn singulariteiten. Deze komen op de plaatsen waar alle gewenste richtingen samenkomen, zodanig dat in valse kleuren kaarten van voorkeursrichting, de regio's rond de singulariteit eruit "pinwheels" (Figuur 2A-B). Een pinwheel per craniotomie is geselecteerd voor.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We een methode om de labeling van neuronale cellichamen (of dendrieten en axonen) in vooraf bepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex richten. Fuserende intrinsieke optisch beeldvorming met twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid te bepalen welke cellen bij synapsen en de micro-domein van elke functionele kaart, of neuronale selectiviteit correleert met de locatie van de neuron in een functionele kaart en de neuronale circuitcomponenten die veranderen met visuele ervaring 7 of de toepassing va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Eye Institute R01EY017925 en R21EY020985 en financiering van de Dana & Whitehall Foundations naar PK We hebben ook Matthew Petrella bedanken voor hulp bij chirurgische procedures; Grace Dion voor het traceren van de dendrieten getoond in figuur 5A en Pratik Chhatbar voor commentaar op het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Naam van de Reagens / Materiaal | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties | |||||
| 1. Life support / experiment prep | ||||||||
| Isofluraan | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | ||||||
| Isofluraan vaporizer | Midmark | VIP 3000 | ||||||
| Terugkoppeling gereguleerde verwarming deken | Harvard Apparatus | 50-7079F | ||||||
| ECG-monitor | Digicare Biomedische | LifeWindow Lite | ||||||
| EEG-versterker | AM Systems | 1800 | ||||||
| EEG monitor | Hewlett Packard | 78304A | ||||||
| Einde tidal CO 2-monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimaliseer ventilatie | |||||
| Hardmetalen boor bramen voor het boren bot | Henry Schein | fijne (0,5 mm tip) en grof (1,25 mm tip) | ||||||
| Cement voor kopplaat / kamer | Dentsply | 675571, 675572 | ||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc | 22-7.185 | Toevoegen aan cement aan het licht afscherming te verbeteren en reflecties te verminderen | |||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | Voor het minimaliseren van pulsaties in de loop van de intrinsieke signaal en twee-foton beeldvorming | |||||
| Dekglaasje: 5 of 8 mm diameter, 0,17 mm dikte | Wereld Precision Instrumenten | 502040, 502041 | Voor het minimaliseren pulsaties tijdens beeldvorming, kan het dekglaasje worden gesneden behoefte | |||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Reiniging schedel oppervlak | |||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Snel stoppen met bloeden | |||||
| Katoen Fooi Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72.308-05 | Schoon en droog botoppervlak | |||||
| Dumont # 5CO Forceps | Fine Science Tools | 11.295-20 | Pak individuele lagen van dura of pia | |||||
| Vannas Spring Schaar | Fine Science Tools | 15.000-03 | Cut dura | |||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | Om het bloeden te stoppen op de dura | |||||
| Absorptie speren | Fine Science Tools | 18.105-01 | Ultrasnelle en niet-pluizende absorberende van CSF | |||||
| Blackout materiaal | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomie | |||||
| 2. Kleurstofpreparaat / injectie | ||||||||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | ||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | ||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium-indicator | |||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | ||||||
| Centrifugaal filter (0,45 urn poriegrootte) | Millipore | UFC30HV00 | Om verontreinigingen te verwijderen vóór de injectie | |||||
| Glazen pipet trekker | Sutter Instrumenten | P97 | ||||||
| Borosilicaatglas filamented capillair (1,5 mm buitendiameter) | Wereld Precisie-instrumenten | 1B150F-4 | Dye uitwerpen pipet | |||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | Voor het laden kleurstof in pipet | |||||
| Micromanipulator | Sutter Instrumenten | MP-285 | Om pipet positioneren | |||||
| Drukpuls controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | Voor druk inspuiten van de kleurstof | |||||
| Single-cell elektroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | Voor elektroporatie van de kleurstof | |||||
| 3. Intrinsieke imaGing | ||||||||
| 4x Doelstelling (0,13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | ||||||
| Intrinsieke hardware / software | Optische Imaging Inc | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software wordt gebruikt voor episodische beeldvorming | |||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | ||||||
| Lichtbron voeding | KEPCO | ATE 15-15M | ||||||
| Lichtbron | Optische Imaging Inc | HAL 100 | Lichtintensiteit op de corticale oppervlak is 3-5 mW | |||||
| Green filter (voor vasculaire comping) | Optische Imaging Inc | λ = 546 nm (30 nm bandbreedte) | Ter referentie beeld van het oppervlak vaatstelsel | |||||
| Rood filter (voor intrinsieke signaal) | Optische Imaging Inc | λ = 630 nm (30 nm bandbreedte) | Om intrinsieke signalen te verzamelen | |||||
| Warmtefilter | Optische Imaging Inc | KG-1 | ||||||
| 4. Twee-foton rig / imaging | ||||||||
| Twee-foton microscoop en software | Prairie Technologies | Zie Shen et al.. 2012 voor lichtpad, filters en laservermogen | ||||||
| Ti: saffier-laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | ||||||
| 20x (0,5 NA; 3,5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0,5 NA doel wordt alleen gebruikt voor het uitlijnen pipet de craniotomie (niet voor twee foton imaging) | |||||
| 20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | ||||||
| 40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | ||||||
| Air tafel | Newport | ST-200 | Isoleert de voorbereiding van externe trillingen | |||||
| xy podium | Mike's Machine Co (Attleboro, MA) | Proefpersoon en Sutter micromanipulator geplaatst op xy tafel | ||||||
|
Referenties
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
