Neste protocolo, demonstramos a fabricação de substratos biomiméticos de cultura de células cardíacas feitos de dois materiais poliméricos distintos usando litografia de força capilar. Os métodos descritos fornecem uma técnica escalável e econômica para projetar a estrutura e a função dos tecidos cardíacos macroscópicos para aplicações in vitro e in vivo.
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Artigo de método
Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo 1. Engenharia de tecidos cardíacos muito promissora para entregar descobertas médicas inovadoras com os objectivos de desenvolvimento de tecidos funcionais para regeneração cardíaca, bem como ensaios in vitro de triagem. No entanto, a capacidade de criar modelos de alta fidelidade de tecido cardíaco tem sido difícil. Matriz extracelular do coração (ECM) é uma estrutura complexa composta de ambos os sinais bioquímicos e biomecânicos que variam a partir do micro-à escala nanométrica 2. Local condições de carga mecânica e interações célula-ECM foram recentemente reconhecidos como componentes vitais em engenharia de tecido cardíaco 3-5.
Uma grande parte do ECM cardíaco é composto por fibras de colágeno alinhados com diâmetros em escala nano que influenciam significativamente a arquitetura do tecido e acoplamento eletromecânico 2. Infelizmente, alguns métodos have foram capazes de imitar a organização das fibras de ECM para baixo para a escala nanométrica. Os recentes avanços em técnicas de nanofabricação, no entanto, permitiram o projeto e fabricação de andaimes escaláveis que imitam os sinais in vivo de rigidez estrutural e substrato do ECM no coração 6-9.
Aqui apresentamos o desenvolvimento de duas reprodutíveis, os processos de microusinagem escaláveis para o alinhamento funcional das células cardíacas usando o poli biocompatível polímero (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) 8 e um poliuretano (PU) de polímero a base de custo-benefício, e. Estes substratos anisotropicamente nanofabricated (ANFS) imitar o ECM subjacente bem organizados, tecidos alinhados e pode ser utilizado para investigar o papel de nanotopografia na morfologia e função das células 10-14.
Usando um mestre de silício nanopatterned (NP), como um modelo, um acrilato de poliuretano (PUA) molde é fabricado. Este molde PUA é então utilizado para pattern o hidrogel PU ou PLGA via assistida por UV ou litografia força capilar mediada por solvente (CFL), respectivamente 15,16. Resumidamente, PU ou PLGA de pré-polímero é gota dispensada para uma lamela de vidro e o molde PUA é colocada em cima. Para CFL assistida por UV, a UP é então exposto à radiação ultravioleta (λ = 250-400 nm) para a cura. Para mediada por solvente CFL, o PLGA é gravado utilizando calor (120 ° C) e pressão (100 kPa). Após a cura, o molde PUA é retirado, deixando para trás um ANFS para cultura de células. Pilhas, como miócitos ventriculares de ratos neonatos, bem como cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas, pode ser mantido no ANFS 2.
Introdução
A doença cardiovascular é a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo e apresentar um peso sócio-econômico importante em uma 1,17 já tenso sistema de saúde global. Engenharia de tecidos cardíacos tem dois objetivos distintos: (1) para regenerar miocárdio danificado após doença isquêmica ou cardiomiopatia ou (2) para a criação de um modelo de alta fidelidade do coração para a triagem de drogas in vitro ou modelagem doença.
O coração é um órgão complexo que deve trabalhar constantemente para fornecer sangue para o corpo. Estruturas laminares densamente embalado de cardiomiócitos e tecidos de suporte são dispost....
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Protocolo
Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente (~ 23 ° C) a menos que indicado de outra forma.
1. Fabricação de Silicon Mestre
- Pastilha de silício Limpe com etanol ou xileno e seco de 100% em O 2 / N 2 gás.
- Coloque bolacha de silício em spin-coater a velocidades de rotação de 2.000-4.000 rpm para produzir um filme de espessura de 0,3-0,5 um.
- Padrão do filme foto-resistente com as dimensões correctas, usando um sistema de fotolitografia
- Totalmente mergulhar as pastilhas de silício revestido de fotossensíveis estampados em um volume adequado de solução photoresist ....
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Resultados
A Figura 1 é uma vista geral esquemática do processo de produção para os dois métodos de fabrico. Devido à difracção da luz causada pela topografia nanoescala, microusinagem deve resultar numa superfície iridescente ao ANFS. Figura 2 representa essa superfície iridescente num bem modelado 25 milímetros NP-PU lamela (Figura 2A) com rebordo 800 nm e ranhura largura (Figura 2B). A aparência iridescente do ANFS vai variar um pouco dependendo do cume e sulco.......
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Discussão
Tecidos cardíacos funcionalmente maduros faltam para tanto in vivo e in vitro em aplicações de engenharia de tecido cardíaco. Os métodos de nanofabricação CFL aqui descritas são técnicas robustas para alcançar o alinhamento celular e influenciando a função do tecido macroscópico devido à escalabilidade do sistema. Grandes áreas podem ser facilmente modelado e usado para a cultura de células. Alinhamento celular macroscópica é essencial em engenharia de tecido cardíaco, a fim de criar biomimético, tecid.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
D. H. Kim agradece ao Departamento de Bioengenharia da Universidade de Washington pelo novo fundo inicial do corpo docente. D. H. Kim também é apoiado pelo Prêmio Perkins Coie de Descoberta, pelo Prêmio de Parceria de Pesquisa Translacional da Fundação Wallace H. Coulter, pelo Fundo de Descoberta de Ciências da Vida do Estado de Washington e pelo Subsídio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association (13SDG14560076). J. Macadangdang e A. Jiao agradecem o apoio do NIH Bioengineering Bolsa de Treinamento Cardiovascular. O apoio adicional para este trabalho vem do R01HL111197 de subsídios do National Institutes of Health (NIH) a M. Regnier.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fibronectina | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Promotor de Adesão de Superfície (Primer de Vidro) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Rolo de Borracha Macia | Speedball | ||
| Bolachas de Silício | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Desenvolvedor | elétrons Shipley | MF320 | |
| JEOL | JBX-9300FS | ||
| Sistema de gravação | de tecnologia de superfície | NP10 8UJ | |
| Sistema de asher de plasma | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Sistema de Cura por Ozônio | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Sistema de Cura por Fusão | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25 milímetros Corning | 2948 | ||
| Sylgard 184 Kit de Elastômero de Silicone | Kit Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poli (D, L-lactide-co-glicolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Clorofórmio | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Pesos | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Álcool isopropílico | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Placa Quente | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson B2510MTH |
Referências
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -H., et al.
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Reimpressões e permissões
