Method Article

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית בחי שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

DOI:

10.3791/50042

⸱

March 15th, 2013

 ,  , 
1Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences , 3Department of Physics, Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor CI 1.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC) לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו מאפשרת לספור את המספרים של מולקולות חלבון היוצר בתא אחד בחלונות זמן רציפים של חמש דקות. זה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם צפיפות הספק עירור ליזר של ~ 0.5-1 קילוואט / 2 סנטימטר, שהוא רגיש מספיק כדי לזהות מולקולות חלבון ניאון בודדות בתאים חיים. כתב הניאון בשימוש בשיטה זו מורכב משלושה חלקים: רצף קרום מיקוד, מהר התבגרות חלבון, צהוב ניאון ורצף הכרת פרוטאז. הכתב הוא התמזג translationally לN-הסופי של חלבון של עניין. תאים גדלים על במת מיקרוסקופ טמפרטורה מבוקרת. כל חמש דקות, מולקולות ניאון בתוך תאים הם צלמו (ומאוחר יותר שיתוףunted על ידי ניתוח תמונות פלואורסצנציה) ולאחר מכן photobleached כך שחלבונים שתורגמו רק לאחרונה נספרים במדידה הבאה.

תמונות פלואורסצנציה נובעות משיטה זו ניתן לנתח על ידי איתור נקודתי ניאון בכל תמונה, הקצאתם לתאים בודדים ולאחר מכן הקצאת תאים לשושלות תאים. מספר חלבונים המיוצרים בתוך חלון זמן בתא נתון מחושב על ידי חלוקת עוצמת הקרינה המשולבת של כתמים מהעוצמת הממוצעת של מולקולות ניאון בודדות. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי למדוד את רמות ביטוי בטווח של 0-45 מולקולות ב 5 חלונות זמן דקות בודדות. שיטה זו אפשרה לנו למדוד את הרעש בביטוי של λ repressor CI, ויש יישומים פוטנציאליים רבים אחרים בביולוגית מערכות.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זרימת עבודת הנדסת מתח

  1. הכנס קידוד רצפים () רצף קרום לוקליזציה, (ב) חלבון מהיר התבגרות פלורסנט ו( ג) רצף הכרת פרוטאז N-מסוף ולמסגרת עם חלבון של עניין (גורם שעתוק לדוגמה). אנחנו השתמשנו הקרום הממוקד כתב TSR-2 ונוס והתמזגנו זה ברצף פרוטאז הכרת יוביקוויטין (UB) לספור את מספר המולקולות הביעו bacteriophage λ מדכאי CI חלבון. פרטים על אופן בו אנו נבנינו חלבון היתוך TSR-ונוס-UB-CI, החלפה פרועה סוג קידוד CI אזור ושילוב המבנה לE. כרומוזום חיידק באמצעות רקומבינציה λ האדום 3, מתואר בפירוט בנ"צ. 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות אופייניות מניסוי CoTrAC מעקב הייצור של λ repressor CI מוצגות באיורי 4, 5. בניסוי זה, 12 מושבות צלמו במרווחי 5 דקות. בכל נקודת זמן, מושבת autofocused הראשון ורכזה בתוך אזור ההדמיה. בשלב הבא, העמדה במרכז / ממוקד הייתה מאוחסנת ותמונת brightfield נרכשה. אז הבמה הייתה translocated ידי ~ 0.5 מיקרומטר לאורך ציר Z-לעבור ממישור המוקד של brightfield למטוס ומפריד בין התאים (ללא שלב ניגוד או לעומת פער התערבות (DIC) אופטיקה, חפצים שקופים למחצה ניתן הדמיה במעט מטוסים מחו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת CoTrAC ניתן להכליל למדוד את הייצור של חלבונים אחרים כאשר N-או קונבנציונלי fusions החלבון פלואורסצנטי C-מסוף עלול לשבש את פעילות חלבון. אסטרטגית CoTrAC יש שלושה יתרונות ייחודיים על פני שיטות קיימות. ראשית, ההיתוך משותף translational מבטיח שמולקולה אחת של כתב הניאון מיוצרת עבור כל מולקולה של החלבון של עניין, המאפשרת ספירה מדויקת של ייצור חלבון בזמן אמת. שנית, כתב קרום הממוקד TSR-ונוס מאפשר זיהוי מולקולה הבודדה של כתבי ניאון, המאפשר זיהוי של חלבונים מתבטאים ברמות נמוכות מאוד. של.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו שום גילויים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCG001 פלסמיד להביע Ubp1 סופק באדיבות על ידי רוהאן בייקר בג'ון קרטין בית הספר למחקר רפואי. עבודה זו מומנה על ידי מצעד הפרוט מענק המחקר 1-FY2011, מרץ הפרס פרוט זיל אוקונור Starter Scholar Research # 5 FY20 ואות קריירה של NSF 0746796.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
Agarose (טמפרטורת התכה נמוכה) Lonza 50100
מילי-Q H 2 O
5 × מלחי M9 המתכון הבא מתואר ב9
20% גלוקוז
MgSO 4
CaCl 2
50 × פתרון חומצת אמין MEM Invitrogen 11130-051
צמיחת טמפרטורה מבוקרתלשכה
מתאם שלב 		BIOPTECHS FCS-2
מחמם אובייקטיבי BIOPTECHS מודל תלוי במטרת מיקרוסקופ
Microaqueduct שקופיות BIOPTECHS 130119-5
משקפים לכסות Micro VWR 40CIR-1 יכול להיות קשה למקור; זמין גם BIOPTECHS
כיסוי זכוכית / אטם שקופית BIOPTECHS 0.75 מ"מ FCS2
מיקרוסקופ פלואורסצנטי שונה הגדרת דוגמה: קוהירנט Innova 308C ארגון יון הליזר, אולימפוס מיקרוסקופ IX-81, 1.45 אובייקטיבי אולימפוס PlanApo 100X NA, Metamorph תוכנה חייב להיות עירור ליזר, שלב xyz אוטומטי, תוכנת אוטומציה מסוגלת הדמיה ופוקוס אוטומטי תסריט, אופטיקה מסוגלים Resolvinחלבוני ניאון בודדים גרם
מצלמת EM-CCD שונה הגדרת דוגמה: תידור iXon DU-898 חייב להיות רעש נמוך מספיק כדי לזהות חלבוני ניאון בודדים מעל הרקע

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
  2. Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single molecule ImagingGene RegulationCoTrAC MethodFluorescence MicroscopyProtein ProductionLive CellsPhotobleaching AnalysisTime lapse ImagingE coli ColoniesFluorescent Reporter

Related Articles