Одиночных молекул изображений регуляции генов<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Использование Cotranslational активацию путем расщепления (CoTrAC)

Краткое содержание

Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод был использован следовать стохастической динамики экспрессии фактора транскрипции, λ-репрессор CI ¹.

Аннотация

Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод позволяет подсчитать количество молекул белка производится в одной ячейке в течение последовательного, пять минут времени Windows. Это требует флуоресцентного микроскопа с лазерным возбуждением плотности мощности ~ 0,5 до 1 кВт / см ^2, что является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить одну флуоресцентных молекул белков в живых клетках. Флуоресцентные репортера, используемые в этом методе состоит из трех частей: мембранной ориентации последовательности, быстро созревания, желтый флуоресцентный белок и последовательность протеазы признание. Репортер трансляционно слитый с N-конца белка. Клетки, выращенные на контролируемой температурой столик микроскопа. Каждые пять минут, флуоресцентных молекул внутри клеток загружаются (а затем и сотрудничествоunted путем анализа флуоресцентных изображений), а затем photobleached так, что только недавно переведенных белков учитываются в следующее измерение.

Флуоресценция изображения в результате этого метода могут быть проанализированы путем обнаружения флуоресцентных мест в каждом изображении, назначая их на отдельные клетки, а затем присвоение клетки к клетке линий. Количество белков, продуцируемых в течение временного окна в данной ячейке рассчитывается путем деления интегрированной интенсивности флуоресценции пятен на среднюю интенсивность одного флуоресцентных молекул. Мы использовали этот метод для измерения уровня экспрессии в диапазоне 0-45 молекул в одном 5 окон мин времени. Этот метод позволил нам измерить шум в выражении λ-репрессор CI, и имеет много других потенциальных приложений в системной биологии.

Протокол

1. Рабочий процесс деформации инженерных

1. Вставьте последовательности, кодирующие (а) мембрана-последовательность локализации, (б) быстрого созревания флуоресцентного белка (в) последовательность протеазы признания N-терминал и в рамке с белком интерес (например, фактор транскрипции). Мы использовали мембраны целевых TSR-Венера репортера ² и плавленого его в последовательность протеазы признание Убиквитин (Ub) для подсчета количества выразил бактериофага λ-репрессор белковых молекул CI. Подробнее о том, как мы построили гибридный белок TSR-Венера-Ub-CI, заменив дикого типа CI кодирующей области и включение в конструкцию E. хромо....

Результаты

Типичные результаты эксперимента CoTrAC отслеживания производства λ-репрессор CI показаны на рисунках 4 и 5. В этом эксперименте, 12 колоний были обследованы на каждые 5 мин. В каждый момент времени, в колонии впервые autofocused и централизованное в рамках изображений регионе. Далее, центрированной / целенаправленной позиции были сохранены и образ светлого был приобретен. Сцена была затем перемещаются на ~ 0,5 мкм вдоль оси перехода от светлого фокальной плоскости в пл.......

Обсуждение

Метод CoTrAC может быть обобщен для измерения производства других белков, где обычные N-или С-концевых флуоресцентного белка слияния могут привести к нарушению активности белка. Стратегия CoTrAC имеет три уникальных преимуществ по сравнению с существующими методами. Во-первых, со-поступательные слияния гарантирует, что одной молекулы флуоресцентного репортер производится для каждой молекулы белка, позволяющие точный подсчет белков производство в режиме реального времени. Во-вторых, мембрана-целевого репортер TSR-Венера .......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Агарозы (низкая температура плавления)	Lonza	50100
Milli-Q H 2 O
5 × M9 соли			Следующий рецепт описан в 9
20% глюкозы
MgSO 4
CaCl 2
50 × MEM аминокислотный раствор	Invitrogen	11130-051
Контролем температуры ростаКамера Переходник между ступенями	Bioptechs	FCS-2
Цель нагревателя	Bioptechs	Модель зависит от объектива микроскопа
Презентация Microaqueduct	Bioptechs	130119-5
Micro очки крышкой	VWR	40CIR-1	Может быть трудно источников; также доступны Bioptechs
Крышка стекла / слайд прокладкой	Bioptechs	FCS2 0,75 мм
Флуоресцентного микроскопа	Различный	Пример настройки: Coherent Innova 308C аргон-ионный лазер, Olympus IX-81 Микроскоп, Olympus PlanApo 100X NA 1,45 цели, Metamorph программного обеспечения	Должно быть лазерного возбуждения, автоматизированные XYZ этапе автоматизации программного обеспечения, способного сценарию изображения и автофокусом, оптикой способны Resolvinг одного флуоресцентных белков
EM-CCD камеры	Различный	Пример настройки: Андор IXON DU-898	Должно быть достаточно низким уровнем шума для детектирования единичных флуоресцентных белков выше фона