本文介绍一种在哺乳动物组织培养细胞中可视化内质网相关mRNA的方法。该技术包括利用皂苷选择性通透细胞膜以去除胞质内容物，随后进行荧光标记 原位 杂交以检测总多聚(A) mRNA 或特定转录本。
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本文内容
摘要
摘要
在真核生物中，编码分泌蛋白和膜蛋白的大多数信使RNA（mRNAs）定位于内质网（ER）表面。然而，这些mRNAs的可视化具有挑战性，尤其当仅有部分mRNA与ER相关联，且其在该细胞器中的分布受到非靶向（non-targeted）mRNA干扰时更是如此。即 “游离”转录本。为了监测与内质网（ER）相关的mRNA，我们开发了一种方法：细胞经短时间暴露于皂苷（digitonin）提取液中，该处理可选择性地通透细胞质膜，从而去除细胞质内容物，同时保持内质网结构的完整性。当该方法与荧光技术联用时 原位 通过荧光原位杂交（FISH），可利用荧光显微镜清晰地观察到内质网（ER）结合的mRNA。根据本实验方案，可评估甚至定量分析总体多聚腺苷酸化（poly(A)）转录本或特定mRNA与内质网的结合程度。在此过程中，还可利用该检测方法探究mRNA与内质网相互作用的性质。
引言
在真核生物中，编码分泌蛋白和膜蛋白的mRNA可通过信号识别颗粒1,2在翻译过程中共翻译地靶向内质网（ER），并在翻译期间通过核糖体与易位子之间的直接相互作用而保留在内质网上3,4。然而，mRNA是否能够在不依赖核糖体或翻译的情况下被靶向并保留在内质网上，直到最近仍不清楚。以往的研究尝试利用细胞分级分离技术来探讨是否存在不依赖翻译的mRNA与内质网的结合。由于需要使用强烈的化学条件才能将核糖体从内质网来源的囊泡上解离，而这些条件可能会破坏潜在的脆弱的mRNA-内质网结合，因此这些研究结果尚无定论，既有支持5-8也有反对9,10核糖体非依赖性mRNA锚定至内质网的证据。
为解决这些问题，我们开发了一种分离和成像内质网结合mRNA的实验方案。该方法包括温和的提取处理，可有效去除细胞中所有细胞质内容物（包括非内质网结合的mRNA），同时保持内质网的形态及其所有相关分子的完整性。利用该方案，我们已证明一部分mRNA能够被靶向并独立于核糖体或翻译过程而稳定地定位于内质网上11。
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方案
1. 提取材料的准备
- 细胞的制备
- 在实验前一天，将组织培养细胞接种于经酸处理的盖玻片上，至少培养一天。我们通常使用 COS-7 或 U2OS 细胞系，因为这两种细胞系能高效表达分泌蛋白，且内质网结构清晰。需要注意的是，为获得较高的提取效率，实验当天盖玻片上的细胞融合度不应超过 80%。
- 若需研究特定的外源 mRNA，可在接种细胞后一天，使用标准转染方法将含有目的基因的质粒转染入细胞。随后让细胞表达该 mRNA 至少 18 小时，再进行提取。
- 用翻译抑制剂处理细胞
- 为检测完整核糖体对 mRNA 与内质网结合状态维持的影响，可使用干扰核糖体与 mRNA 结合的翻译抑制剂处理细胞11。
- 翻译起始抑制剂，如高哈尔满廷（homoharringtonin, HHT）、帕卡霉素（pactamycin）或 2-(4-甲基-2,6-二硝基苯胺基)-N-甲基丙酰胺（MDMP），可阻止新的核糖体与转录本结合，同时允许已结合的核糖体完成翻译过程12-14。由于哺乳动物细胞中大多数蛋白质的翻译速率约为每秒 5 个氨基酸，不受密码子使用频率或 mRNA 长度的影响15，因此经过 30 分钟处理后，理论上可使开放阅读框长达 27,000 个核苷酸（编码长达 9,000 个氨基酸的蛋白质）的 mRNA 上的核糖体完全脱....
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结果
为了确定与内质网（ER）相关的mRNA比例，将转染了含有胎盘碱性磷酸酶（ALPP）或细胞色素P450-8B1（CYP8B1）质粒的COS-7细胞分为两组：一组用洋地黄皂苷提取后固定，另一组直接固定（见图1，比较“未提取对照”与“提取对照”）。在两组样本中定量分析了细胞核外的荧光信号，并计算了ER相关mRNA的比例（图2）。我们的数据明确显示，对于ALPP和CYP8B1这两种mRNA，约有60%的细胞质mRNA与内质网相关。由于这两种mRNA均编码在内质网腔内加工的蛋白质，因此我们的结果支持这类mRNA在内质网表面进行翻译的观点。
为了在核糖体解离后监测这些转录本与内质网（ER）的关联情况，将转染的COS-7细胞分别用对照培养基、嘌呤霉素或HHT处理30分钟，随后进行提取、固定，并使用针对每种mRNA的特异性FISH探针进行染色（代表性图像见图1，ER和细胞核相关mRNA的定.......
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讨论
mRNA通过与mRNA定位蛋白相互作用，被运输至细胞内不同亚细胞区域，这一现象广泛存在，对于蛋白质正确分选至其最终定位以及根据亚细胞区域的局部需求精细调控基因表达具有重要意义19,20。
利用本文所述的检测方法，我们重新探讨了编码分泌蛋白的mRNA是否能够在有或无核糖体及翻译的情况下维持在内质网（ER）上的问题。事实上，我们发现这类mRNA中有一部分具有这种活性11。例如，通过本提取方案，我们确定在对照处理的COS-7细胞中，ALPP 和 CYP8B1 mRNA均定位于内质网表面（图1-2）。然而，在用翻译抑制剂嘌呤霉素或HHT处理细胞后，只有ALPP mRNA（而非CYP8B1 mRNA）在缺乏功能性核糖体和翻译的情况下仍与内质网保持关联（图1, 3）。此外，我们先前还发现，在用嘌呤霉素处理的COS-7细胞中，ALPP mRNA仍与内质网保持关联11。由于这些.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会向 X.A.C. 和 A.F.P. 提供的资助。
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参考文献
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G.
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重印与许可
