Transfection החלבון של ריאות מאוס

Summary

עכברים מהונדסים או וקטורים נגיפיים היו בשימוש כדי להגדיל את ביטוי חלבון בתוך הריאה. עם זאת, הטכניקות האלה הן זמן רב, מאתגרים מבחינה טכנית ויש השפעות מחוץ היעד שיכול לבלבל את התוצאות. פרוטוקול transfection שלנו משתמש בחלבון מגיב transfection מבוסס שומנים וmicrosprayer ultrafine כדי לספק חלבון פעיל באופן אחיד לתאי ריאה.

Abstract

הגדלת ביטוי חלבון מאפשרת לחוקרים להבין טובים יותר את התפקיד הפונקציונלי של חלבון זה בויסות תהליכים ביולוגיים מרכזיים ^1. בסרטן הריאות, זה הושג בדרך כלל באמצעות גישות גנטיות המנצלות עכברים הטרנסגניים ^2,3 או וקטורים ויראליים או לא ויראלי שמעלים רמות חלבון דרך ביטוי גנים מוגבר ^4. עכברים מהונדסים הם יקרים וגוזלים זמן ליצירה וההחדרה של ביטוי transgene או כרוני גנטי האקראית יכולה לשנות את התפתחות ריאות נורמלית ובכך להגביל את התועלת של מודל ^5. בעוד transgenics המותנה למנוע בעיות הקשורות לביטוי כרוני גן ^6, את transactivator (rtTA) עכברי טטרציקלין שהשליטה ההפוכים, שמשמשים ליצירת ביטוי תנאי, לפתח הגדלת מרחב אווירי ספונטנית ^7. כמו עם transgenics, השימוש בוקטורים ויראליים ולא ויראלי הוא יקר ⁸ ויכול לעורר מינון-Dתגובות דלקתיות ependent הרודפות את התוצאות ⁹ ולעכב את הביטוי ^10. יתר על כן, היעילות של מינונים חוזרים ונשנים הן מוגבלת על ידי תגובה חיסונית משופרת לווקטור ^11,12. חוקרים מפתחים adeno הקשורים וקטורים (AAV) יראליות שיעוררו פחות דלקות ולהיות ביטוי ארוך יותר בתוך הריאות ^13.

באמצעות β-גלקטוזידאז, אנו מציגים שיטה לביטוי חלבון גדל במהירות וביעילות בתוך הריאות באמצעות טכניקת transfection חלבון ישירה. פרוטוקול זה מערבב כמות קבועה של חלבון מטוהר עם 20 μl של מגיב transfection מבוסס שומנים (Pro-JECT, פירס ביו) כדי לאפשר חדירה לתוך רקמת הריאה עצמה. תערובת חלבוני liposomal לאחר מכן הוזרקה לריאות של העכברים באמצעות קנה הנשימה באמצעות microsprayer (פן המאה, פילדלפיה, פנסילבניה). Microsprayer יוצר פלומה דקה של תרסיס נוזלי לאורך הריאות. באמצעות הטכניקהאנו הוכחנו בתצהיר אחיד של החלבון המוזרק לאורך כל דרכי הנשימה ואת alveoli של עכברים ^14. טכניקת transfection השומנים מאפשרת שימוש בכמות קטנה של חלבון כדי להשיג את האפקט. זה מגביל את התגובה הדלקתית שאחרת היה עוררה על ידי ממשל חלבון גבוה. ואכן, שימוש בטכניקה זו שפרסמנו כי הצלחנו להגדיל את הפעילות בPP2A הריאות באופן משמעותי מבלי להשפיע על ריאות תאיות שטיפת ^15. cellularity שטיפת הריאות נלקחו 24 שעות לאחר האתגר היה דומה לקבוצת ביקורת (27 ± 4 שליטה לעומת 31 ± 5 transfected אלבומין, n = 6 לכל קבוצה). יתר על כן, הוא מגביר את רמות חלבון ללא גרימת שינויים התפתחותיים ריאה או שינויים ארכיטקטוניים שיכול להתרחש במודלים מהונדסים. עם זאת, את הצורך בממשלים חוזרים ונשנים עלול להפוך טכניקה זו פחות נוחה למחקרים הבוחנים את ההשפעות של עלייה ארוכת טווח בביטוי חלבון. זה יהיה בעיקר Truדואר לחלבונים עם זמן מחצית חיים קצרים.

Protocol

1. הכנה של מגיב Transfection חלבון

1. ממיסים את מגיב Pro-JECT על ידי הוספת 250 μl של מתנול או כלורופורם לצינור המכיל את הסרט היבש.
2. וורטקס עבור 10-20 שניות במהירות שיא.
3. פיפטה μl 20 של מגיב Pro-JECT לתוך צינורות microcentrifuge נפרדים.
4. להתאדות הממס על ידי הנחת הצינורות המכילים microcentrifuge מגיב Pro-JECT מתחת למכסת מנוע זרימה למינרית למינימום של 6 שעות בטמפרטורת חדר. זה חייב להיות יבש לחלוטין. לחלופין, לייבש את מגיב Pro-JECT באמצעות ייבוש ואקום.
5. אחסן את הצינורות ב -20 ° C. הם טובים לשנה אחת בטמפרטורה זו.

2. הוספת חלבון למגיב Pro-JECT

1. פיפטה μl 50 של PBS, המכיל 2.0 מיקרוגרם של החלבון של עניין, לתוך צינור המכיל 20 μl של מגיב transfection Pro-JECT מיובש.
2. לאחר הוספת החלבון, מערבב את הפתרון על ידי F vortexing במהירות הנמוךאו 3-5 שניות ואחריו דוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.

3. מנהל intratracheal של חלבון

1. הרדימי עכברים על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין / xylazine (100 מ"ג / ק"ג ו 10 מ"ג / ק"ג).
2. לאחר ההרגעה מושגת, עכברים הושעו מהחותכות העליונות שלהם באמצעות פלטפורמה שתוכננה במיוחד (איור 1).
3. בעזרת מלקחיים ומהדק נייר כראי גרון, הלוע התחתון נפתחים, כך שיכול להיות הציג את הקטטר (איור 2). מיתרי הקול הם דמיינו ידי הצבת מקור אור נגד קנה הנשימה של העכבר.
4. התערובת מגיב חלבון / פרויקט (50 μl) מוזרקת דרך קנה הנשימה באמצעות Microsprayer המאה פן.

Representative Results

כדי להדגים את היעילות של הטכניקה שלנו השתמשתי microsprayer (המאה פן) להזריק את קנה הנשימה של עכברים עם 2 מיקרוגרם של עכבר אלבומין (Sigma) מומס 50 μl של PBS שהכיל 20 μl של מגיב transfection Pro-JECT. העכברים שטופלו אלבומין הושוו לעכברים שטופלו באופן זהה עם 2 מיקרוגרם חלבון בטא גלקטוזידאז של (פירס ביו). לאחר עשרים וארבע שעות, העכברים היו מורדמים והריאות עובדו לניתוח היסטולוגית. אימונוהיסטוכימיה לבטא גלקטוזידאז נערכה על סעיפי רקמות ריאה קבועים פורמלין מהעכברים שטופלו אלבומין ובטא גלקטוזידאז. אפילו 24 שעות לאחר transfection החלבון, זיהינו כתמים אינטנסיביים תוך דרכי הנשימה (חיצים גדולים) של העכברים שטופלו בטא גלקטוזידאז אך לא את העכברים שטופלו אלבומין (איור 3 א ו 3 ב).

_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
איור 1. כדי למקם את העכברים להזרקת intratracheal, פלטפורמת עץ נבנתה שיש רמפה בזווית של 45 מעלות מבסיסו ^16. העכברים מושעים מהחותכות שלהם על ידי חוט מתכת מחובר לשני ווי מתכת בחלק העליון של הרמפה. הלשון היא מיקומו בעדינות עם מלקחיים וראי גרון מהדק נייר משמש כדי לפתוח את דרכי הנשימה.

איור 2. לאחר הצבת מקור אור על הצוואר, הגרון יכול להיות דמיינו להזרקת intratracheal ^16.

איור 3. immunostains β-גלקטוזידאז נערכו בחלקי ריאה 4 מיקרומטר מעכברים שהוזרקו intratracheally עם 2 מיקרוגרם שלאלבומין () או β-גלקטוזידאז (ב '). חצים מצביע על כתמי β-גלקטוזידאז בדרכי נשימה. תמונות הן בהגדלה 40X. בר סולם = 100 מיקרומטר.

Discussion

היתרון של שיטה זו על פני שיטות אחרות הוא שזה מייצר עליות ברמות חלבון ופעילות בתוך רקמת הריאה עצמה. יתר על כן, זה חודר לאזורים המרוחקים ביותר של הריאות בניגוד להישאר רק בתוך את דרכי הנשימה. יש לנו למדוד פעילות מוגברת של חלבון injectate גם לאחר lavaging איירווייס עם ¹⁵ מלוחים. ניתוחי פעילות רקמה מצביעים על כך שהחלבון הוא להיכנס לתאים ולא רק להישאר בחללי האוויר של העכבר. זה היה עוד יותר מאושר על ידי אימונוהיסטוכימיה מדגימה מכתים מפוזר של החלבון המוזרק שלנו בתוך alveoli ודרכי הנשימה של העכבר (איור 3). חשוב מכך, פרוטוקול זה לא להתגרות דלקת ריאות או ביטוי פרוטאז. לפיכך, ניתן לייחס את כל שינויים שמתרחשים להשפעות של החלבון מנוהל. חוסר התגובה דלקתית מאפשר את השימוש בזריקות חוזרות ונשנות לבחינת השפעות על longeתקופת R של זמן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pro-Ject	Pierce Bio	89850
Microsprayer	Penn Century	FMJ-250
Beta-galactosidase	Pierce Bio	89850
Beta-galactosidase antibody	Santa Cruz Bio	SC-19119
Mouse serum albumin	Sigma Aldrich	A3139
Ketamine/xylazine	Sigma Aldrich	K113