Анализ растворителей доступность остатков цистеина на Кукуруза rayado Fino вирус Вирус типа частиц, образующихся в Nicotiana benthamiana Растения и Перекрестное связывание пептидов VLPs

Summary

Метод анализа растворителей доступность тиоловые группы остатков цистеина в Кукуруза rayado Fino вирус (MRFV)-вирус типа частиц (VLP), а затем пептида реакции сшивания описано. Метод использует преимущества наличия нескольких химических групп на поверхности ВПЧ, которые могут стать мишенью для конкретной реакции.

Abstract

Имитация и эксплуатации вирус свойства и физико-химические и физические характеристики держит обещание дать ответы на некоторые из наиболее актуальных проблем в мире. Сам диапазон и типы вирусов в сочетании с их интригующими свойствами потенциально дают бесконечные возможности для применения в вирус-технологий. Вирусы имеют возможность самостоятельно собираться в частицы с дискретной формы и размера, специфики симметрии, поливалентности и стабильные свойства в широком диапазоне температур и рН условиях. Не удивительно, что с таким замечательным набором свойств, вирусы предложены для использования в биоматериалов ^9, вакцины ^{14, 15,} электронных материалов, химических средств и молекулярных электронных контейнеров ^{4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12.}

Для того чтобы использовать вирусы в области нанотехнологий, они должны быть изменены с их естественной формы, чтобы придать новые функции. В этом сложном пр.ocess может осуществляться посредством нескольких механизмов, включая генетические модификации вирусного генома и химически крепления иностранной или желаемой молекулы вирусной частицы реактивные группы ^8. Возможность изменять вирус в первую очередь зависит от физико-химических и физических свойств вируса. Кроме того, генетические или физико-химические изменения должны быть выполнены без ущерба для нативной структуры вируса и вируса функции. Кукурузы rayado Fino вируса (MRFV) белков пальто самостоятельно собираться в кишечной палочки получения стабильных и пустые ВПЧ, которые стабилизировать белок-белковых взаимодействий и которые могут быть использованы в вирусных технологий на основе применения ^8. VLPs производится в растениях табака были рассмотрены как эшафот, на котором различные пептиды могут быть ковалентно отображается ^13. Здесь мы описываем шаги: 1) определить, какие из доступных растворителей цистеина в капсид вируса доступны для модификацийкатионов, и 2) Bioconjugate пептидов изменение капсид. С помощью родных или мутационно вставлен аминокислотных остатков и стандартных технологий связи, широкий спектр материалов были выставлены на поверхности вирусов растений, таких как, Brome вируса мозаики ^3, гвоздика пятнистости вируса ^12, Вигну хлоротичных пятнистости вирус ^6, табачной мозаики Вирус ^17, репа вирус желтой мозаики ^1, и MRFV ^13.

Protocol

1. Прививка Вирус ВПЧ и очистки от растений Nicotiana benthamiana

1. Продукция ограничен T7-РНК-транскрипты из картофельного вируса X (PVX)-плазмиды на основе вектора, несущего MRFV дикого типа (WT) и Cys-мутировал белка оболочки (CP) генов ^12, с использованием Ambion в T7-mMessage mMachine Kit.
2. Для каждой реакции стенограммы T7, прививают два полностью расширена листьев N. benthamiana с 10 мкл реакции и инкубировать растений в течение 10 дней в теплице, при 60% влажности в течение 16 часов со светом (25,000-30,000 люкс) при 25 ° C и 8 часов темноте при 20 ° C.
3. Harves т Н. benthamiana инфициро....

Results

Переходный выражение мутантного белка оболочки MRFV (CP) генов в N. benthamiana растений в PVX-вектора на основе производства VLP, представлена ​​на рисунке 1. Изменения пальто MRFV гена белка усиливается с помощью ПЦР, а затем помещен под транскрипционный контроль дублируется промоутер CP субгеномный в PVX на основе вектора, pP2C2S ^2, (подарок D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Норвич, Англия). В пробирке транскрипции РНК производит РНК-транскрипты, которые затем использ.......

Discussion

Метод, представленный здесь, дает очень чувствительный и быстрый анализ реактивных цистеина, присутствующего на поверхности растений производства VLP, а также на других белковых комплексов. Малеимиды являются тиол-специфических реагентов, которые вступают в реакцию с свободных сульфгидрильных-содержащих молекул к образованию устойчивых связей тиоэфир. Этот метод опирается на специфику малеимиды в реакцию с сульфгидрильных групп, не участвующих во взаимодействии с другими аминокислотами. Сохранение нативной структуры VLP.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Тонкостенных, Ultra-Clear трубы	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit	Жизнь Tecnologies	AM1344M
Флуоресцеин-5-Maleimide	Thermo Технологии Научная жизнь	46130 F150	46130 вышла из строя замена с F150
Пирс Биотин Количественный Kit	Thermo Scientific	28005
EZ-Link Maleimide-PEG2-биотин, No-взвешивание формат	Thermo Scientific	21901
SM (PEG) п Сшивающие агенты	Thermo Scientific	22107
10-20% Трис-глицин гель	Invitrogen	EC61352
Laemmli буфера	Bio-Rad	1610737
Трис-глицин SDS Запуск буфера	Invitrogen	LC2675
Трис-глицин Передача буфера	Invitrogen	LC3675
Нитроцеллюлозные мембранные фильтр Sandwich бумаги	Invitrogen	LC2001
Фосфатазы Маркированный аффинно очищенные антитела к IgG кролика	Kirkegaard и Perry Laboratories	0751516
NBT / BCIP фосфатазы основания	Kirkegaard и Perry Laboratories	508107