نحن هنا وصف تقنية الأمثل لإنتاج عالية الجودة فيتامين A معقدة RBP / واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة فيتامين A النقل STRA6، ومستقبلات RBP.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فيتامين A ضروري لرؤية و. النمو / التفريق بين جميع أجهزة الإنسان تقريبا الريتينول البلازما بروتين ملزمة (RBP) هو مبدأ والناقل محددة من فيتامين A في الدم. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإنتاج وتنقية هولو-RBP واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة النقل من فيتامين A من قبل مستقبلات RBP عالية تقارب STRA6. أول تقنية يجعل من الممكن لإنتاج كمية كبيرة من نوعية عالية هولو-RBP (100٪ محملة الريتينول) لفيتامين (أ) المقايسات النقل. عالية الجودة RBP أمر ضروري لفحوصات الفنية لتتجمع RBP النشرات فيتامين A تلوث بسهولة والبكتيرية في إعداد RBP يمكن أن يسبب التحف. جعلت تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي مثل الكهربية إسهامات حاسمة في دراسات النقل الغشاء. لم يتم النقل RBP الريتينول مستقبلات بوساطة تحليلها في الوقت الحقيقي حتى وقت قريب. والأسلوب الثاني هو موضح هنا الجرميةل في الوقت تحليل الإفراج الريتينول STRA6 المحفزة أو التحميل. أسلوب الثالث هو في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة النقل من الريتينول هولو-RBP إلى الريتينول الخلوية I بروتين ملزمة (CRBP-I). هذه التقنيات توفر حساسية عالية في الكشف والقرار فيتامين A في RBP مستقبلات آلية الامتصاص.
المقدمة
فيتامين A هو جزيء العضوية التي لا غنى عنها لبقاء الإنسان وحسن سير جميع أجهزة الإنسان تقريبا. فيتامين A المشتقات (الرتينوئيدات) المشاركة في مختلف الأحداث البيوكيميائية والخلوية بما في ذلك الاستشعار من الضوء لرؤية 1،2 وتنظيم التعبير الجيني والترجمة البروتين أثناء التطور الجنيني والكبار في الأنسجة 3-6. على الرغم من الريتينول لديه القدرة على نشر نظام ككل، وجاء مع تطور البلازما بروتين ملزمة الريتينول، وهو بروتين الناقل محددة لفيتامين (أ) النقل في الدم لتحقيق الكفاءة العالية والدقة وتجنب السمية المرتبطة نشر عشوائي 7-10. A مستقبلات عالية تقارب الممارسات التجارية التقييدية التي تربط لويستغرق فيتامين A ك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الإنتاج، وطوي ثانية، وتنقية HPLC من هولو-RBP
- تحويل BL-21cells مع ناقلات pET3a لإيواء [كدنا] RBP الإنسان مع البطاقات صاحب 6X على محطة-N. تحول زراعة BL-21 في الخلايا شاكر في C ° 37 في 40 مل مع وسائل الإعلام LB كربنيسيلين حتى OD في 600 نانومتر تصل إلى 0.5. حمل RBP التعبير البروتين بإضافة IPTG ل1MM. تنمو هذه البكتيريا في 37 ° C آخر 5 ساعة.
- RBP القولونية المنتجة في الوقت الحاضر هو في الغالب غير قابلة للذوبان في الهيئات إدراج. لإثراء الهيئات إدراج، الخلايا بيليه في 10،000 XG لمدة 20 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نقدم نتائج ممثلة هنا للهولو-RBP إنتاج وتنقية من قبل HPLC (الشكل 1)، في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة الإفراج الريتينول من هولو-RBP وتحميل الريتينول إلى APO-RBP (الشكل 2) في الوقت الحقيقي وتحليل STRA6 المحفزة الريتينول النقل من هولو-RBP لEGFP-CRBP-I (الشكل 3).
دون طوي ثانية، أنتجت RBP في البكتيريا وتتجمع تقريبا تماما بسبب وجود العديد من السندات ثاني كبريتيد غي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن هنا لتبادل الإنتاج RBP الأمثل لبروتوكول RBP إنتاج وتنقية الإجراءات الحاسمة لتوليد RBP مطوية بشكل صحيح. نظرا لإمكانية الأنواع RBP تتجمع وجود كميات ضئيلة من البروتينات البكتيرية حتى في HPLC تنقية البكتيريا المنتجة RBP، فمن المفيد استخدام الممارسات التجارية التقييدية الأصلية من المصل لتأكيد استنتاج المتعلقة RBP. RBP البول، والذي يتوفر تجاريا، هو خليط معقد من الأنواع بما في ذلك العديد من الممارسات التجارية التقييدية APO-RBP وهولو-RBP 48،49.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01EY018144.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف / المواد | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
| الجوانيدين هيدروكلوريد | EMD | 5010 | |
| سيستين | سيجما | C8755 | |
| السيستين | سيجما | C7352 | |
| EDTA | الصياد | BP118-500 | |
| تريس | الصياد | 7786-1 | |
| DTT | EMD | 3860 | |
| الريتينول | سيجما | R7632 | |
| كربنيسيلين | الصياد | BP2648-5 | |
| IPTG | EMD | 5810 | |
| PBS | EMD | 6508 | |
| كلوريد الصوديوم | الصياد | BP358-10 | |
| ني NTA | QIAGEN | 1018244 | |
| إيميدازول | EMD | 5720 | |
| هيبتان | EMD | HX0295-1 | |
| مانع الكازين | خرق | 37528 | |
| Amicon الترا المكثف 15 (MWCO10 K) | ميليبور | UFC901024 | |
| Microfluor-2 لوحة | الصياد | 14-245-177 | |
| هاميلتون حقنة Gastight # 1710 | الصياد | 14-824-655 |
المراجع
- Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
- Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential ther....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
