인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

요약

우리는 인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 능성 피부에서 파생 된 전구체 (SKP) 세포를 분리하는 방법을보고합니다. 우리는 섬유 아세포 문화에서 파생 된 이러한 SKPs은 인간의 피부 생검에서 직접 파생 된 것과 유사한 줄기 세포 특성을 공유하는 것을 보여줍니다. 이러한 세포는 OCT4와 나노 등 능성 마커뿐만 아니라 신경 능선 마커 스틴을 표현한다.

초록

지난 십 년간, 여러 성체 줄기 세포 집단은 인간의 피부 ^1-4에서 발견되었습니다. 능성 성인 피부 전구체의 분리가 처음 밀러 F. D 연구소 ^{5, 6에} 의해보고되었다. 이러한 초기 연구는 성인 포유류의 진피 ^5에서 다 능성 전구 세포 인구를 설명했다. 이러한 세포 -라고 SKPs, 피부 파생 된 전구체는 - 격리와 설치류와 인간의 피부에서 확장하고 뉴런 ^5와 같은 피부 발견되지 않았다 세포 유형 등 신경과 중배엽 모두 자손,로 분화되었다. 배양 SKPs에 면역 세포 연구는 세포가 피브로넥틴 및 다 능성 줄기 세포 마커 ^6에 추가 vimentin에와 스틴, 신경과 골격 근육의 전구체로 표현 중간 필라멘트 단백질을 발현 것으로 나타났다. 지금까지 성체 줄기 세포 인구 SKPs 갓 수집 포유류의 피부 생검에서 분리되었다. ve_content는 "> 최근에, 우리는 설립과 피부 유래 전구 세포의 인구는 피부 생검 ^7에서 설정된 기본 섬유 아세포 배양에 존재 남아있을 것으로보고있다. 몇 체세포 줄기 세포가 초기 인구 계대에서 차 섬유 아세포 배양에 상주 할 수있는 가정이었다 다음과 같은 관측에 따라 : (1) SKPs 및 기본 섬유 모세포 배양 진피에서 파생 된, 그리고 SKP 세포 따라서 소수의 1 차 피부 섬유 아세포 배양에 존재 남아있을 수 있으며, (2) 주요 섬유 아세포 배양했습​​니다 냉동 분주에서 성장 ⁷ 가능한 남아 세포의 작은 숫자가 포함 된 저장 또는 전송 중에 불리한 온도에 노출.이 드문 세포는 여러 번 확장 및 계대 수있었습니다.이 관찰 제안하는 높은 확산 힘과 스트레스에 대한 저항을 가진 세포의 작은 숫자 인간 섬유 아세포 배양 ⁷ 참석했다.

우리는 전세계 조직 은행 (그림 1)에서 쉽게 사용할 수있는 기본 섬유 모세포 배양에서 성체 줄기 세포의 빠른 분리를위한 프로토콜을 설정하는 이러한 연구 결과를 이용했습니다. 피부 샘플에 액세스 할 수없는 경우 섬유 아세포 문화의 분자 희귀 유전 질환을 기본 메커니즘뿐만 아니라 모델링 질병을 해부 할 수있는 새로운 기회를 열어, 따라서, 조직 은행에서 구할 수 있지만이 전구 세포의 분리를 허용하는이 방법은 중요한 의미가있다 요리.

프로토콜

1. 차 섬유 아세포 배양에서 SKP 분리

1. 세포 은행에서 직접 피부 생검에서 얻은 하나 섬유 아세포 배양 섬유 모세포 성장 배지 DMEM 15 % 태아 송아지 혈청, 2 MM의 글루타민, 10 MG / ML 페니실린, 10 MG / ML 스트렙토 마이신을 포함의 문화에 유지됩니다.

인간 섬유 아세포 GMO3349C 및 GMO8398A는 의료 연구를위한 Coriell 연구소 (캠든, NJ)에서 얻은 본 연구에 사용 하였다.

2. 인구 계대에서 배양 (PPD가) 20 35 80 %의 confluency에에 SKP 문화를 위해 사용되었다. 한 10cm 조직 문화 접시 (BD 팔콘)는 약 1.5x10 ⁶ 셀이 포함되어 있습니다.
3. 37 1 시간 2 ML 트립신 용액 (0.25 %, Invitrogen 사) ° C.와 PBS와 부화와 세포를 씻으
4. 5 ML PBS와 함께 접시에에서 세포를 수집하고 15 ML 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
5. 24 시간 동안 4 ° C에서 세포를 품어.
6. DMEM-F12 3:1 (V / V) 40 NG / ML FGF2 (BD Biosciences는, 20 NG....

결과

우리는 우리가 최근 ^7보고 된 선택적으로 EGF와 FGF2으로 구성된 통제 성장 조건 하에서 SKP 분야를 생성하기 위해 확장 세포의 인구는 기본 피부 섬유 아세포 배양 (그림 1)에 존재하는 것을 보여줍니다.

일반적으로 세포 은행에서 제공하는 기본 섬유 아세포의 변종에 해당하는 PPD가 15 일부터 25 일까지 섬유 아세포 배양 본 연구에 사용 하였다. 이 방법에서 설명하는 24 시간 동안 자양물 고갈과 함께 저온 처리로 구성된 이중 치료에 제출 섬유 아세포 배양 한 것과 유사한 성장 특성을 공유하는 부동 분야를 (또한 배아 몸 EB으로 함)가 포함 재현성 생성 된 문화를 직접 파생 SKPs 이전에 설명 피부 샘플 ^{7, 9에서.}

여기에서 우리는 우리가 최근 ^7보고 한 방법을 사용하는, 우리는 CE의 인구를 분리 표시고립 neurosph.......

토론

방법을 사용하여 여기에 설명, 순진 피부 줄기 세포는 기본 피부 섬유 아세포 배양에서 분리 할 수​​ 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 최근 희귀 유전 증후군, 허친슨 - 길 포드 조로증 증후군 ⁷ 명에서 유래 섬유 아세포 배양에서 성체 줄기 세포의 분리 및 특성을보고했다. 로 그 전구체 세포 표현 줄기 세포 마커 자기 갱신 할 수 있으며 (자세한 벤첼 등.에 의해 그림 4 참조, 2012) 섬유 아세포와 평활근 세포 ^7을 포함한 다양한 세포 계통으로 분화하도록 지시 할 수 있습니다 여기에 표시됩니다. 이 방법은 이전에 포유류의 피부 샘플 ^10에서 SKPs의 분리에 대해보고하는 방법에 여러 가지 이점을 제공합니다. SKP는 하나 갓 피부 생검이나 이미 존재하는 기본 섬유 모세포 배양에서 설정하는 기본 섬유 모세포 배양에서 분리 할 수​​ 있으며 얻을 수 있습니다세계의 세포 은행.에서 이 새로운 접근 방식은 피부 샘플을.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM 고당	인비트로겐	31966-047
DMEM 저당	인비트로겐	21885-108
소 태아 혈청	인비트로겐	10270-106
L-글루타민	인비트로겐	25030-024	최종 농도: 200 mM
페니실린/ 스트렙토마이신	인비트로겐	15140-122	최종 농도: 10 mg/ml /10 mg /ml
트립신 용액 (0.25 %)	Invitrogen	25200-056
F-12 영양 혼합물 (햄)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	최종 conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 플라스크	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield 마운팅 매체	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	최종 conc.:1 mg/ml
표 2. 특정 시약 및 장비.