Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

Summary

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Abstract

O desenvolvimento de microarrays de todo o transcriptoma e sequenciamento de próxima geração que revolucionou a nossa compreensão da complexidade da expressão gênica celular. Juntamente com uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos, medições precisas da cinética subjacentes tornaram-se cada vez mais importante. Aqui, essas metodologias poderosas enfrentam grandes limitações devido às propriedades intrínsecas das amostras de modelos que estudam, ou seja, total de RNA celular. Em muitos casos, mudanças de RNA celular total de ocorrer ou muito devagar ou rápido demais para representar os eventos moleculares subjacentes e sua cinética com resolução suficiente. Além disso, a contribuição de alterações na síntese de ARN, o processamento, e da deterioração não são facilmente diferenciados.

Recentemente, desenvolveu perfis de alta resolução expressão gênica para superar essas limitações. A nossa abordagem baseia-se na marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-thiourijante (portanto também designado por 4SU-tagging) seguido por purificação rigorosa do ARN recém transcritos usando biotinilação específica do tiol e as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. A técnica é aplicável a uma ampla gama de organismos, incluindo vertebrados, Drosophila e levedura. Foram aplicados com sucesso 4SU codificação para estudar a cinética em tempo real das actividades de factor de transcrição, proporcionar medições precisas da RNA meia-vida, e obter novos conhecimentos sobre a cinética de processamento do ARN. Finalmente, a modelagem computacional pode ser empregue para gerar uma análise global integrado dos mecanismos moleculares subjacentes.

Introduction

Perfil de expressão gênica é uma ferramenta chave usada para estudar os processos celulares e da rede complexa interação associado. Estudos sobre a abundância de ARNm foram tipicamente o método de escolha para obter conhecimentos básicos sobre os mecanismos moleculares subjacentes. O desenvolvimento de microarrays de todo o transcriptoma ¹ e, mais recentemente, o sequenciamento de próxima geração de RNA (RNA-seq) ^2-4 alimentou esta abordagem. Embora estas tecnologias revolucionaram nossa compreensão da complexidade da expressão gênica celular, eles enfrentam grandes limitações devido às propriedades intrínsecas de sua amostra do modelo, ou s....

Protocol

1. Marcação metabólica com 4-tiouridina

Faça um plano detalhado da instalação experimental / programação, por exemplo, quando adicionar o 4SU para cultura de células e quando a colheita das amostras. Plano de pelo menos 5 minutos entre cada condição. Apenas o tratamento de células de uma condição de cada vez. Lidar com máx. 3-5 pratos em um determinado momento. Pega células tão rapidamente quanto possível, para minimizar as alterações nos níveis de temperatura e de CO _2. Evite expor as células à luz brilhante após 4SU é adicionado como isso pode resultar em crosslinking de RNA 4SU-rotulados para proteínas celulares.

....

Results

1. Material de Partida e os rendimentos esperados

Após 1 hora (hr) de 4SU-exposição de RNA recentemente transcrito representa cerca de 1-4% do RNA celular total. Esta será mais baixa em células de crescimento a ser preso em que já não conta para sintetizar o RNA para o crescimento celular / replicação. Quando a rotulagem por 1 hr, recomendamos iniciar o ensaio com 60-80 mg de RNA total. Começando com menos de 30 ug de RNA total de resultados em peletes pequenas de RNA que são difíceis de ver, a.......

Discussion

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita aumenta substancialmente o poder das tecnologias de alto rendimento, como microarrays e RNA-seq, fornecendo modelos mais adequados para lidar com a questão biológica de interesse. O presente protocolo foi extensivamente otimização. Ele permite o enriquecimento> 1.000 vezes maior de RNA recentemente transcrito e proporciona resultados altamente reprodutíveis.

O delineamento experimental do experimento 4SU-tagging é de crucial importância como RNA.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-tiouridina	Carbosynth	T4509	Prepare o estoque de 50 mM em H2O estéril, armazene a -20 > C em alíquotas de 50-500 μ l, descarte o reagente não utilizado, não congele novamente.
Trizol	Invitrogen	15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)	AVISO - CORROSIVO e PERIGOSO PARA A SAÚDE! Garanta o acesso imediato ao antídoto de fenol (PEG-Metanol); Armazene a 4 ° C.
Clorofórmio	Sigma	372978	AVISO - PERIGOSO PARA A SAÚDE
Isopropanol	Sigma	650447
Citrato de sódio, sem nuclease	Sigma	C8532	Prepare a solução-mãe de 1,6 M usando água sem nuclease.
NaCl livre de nuclease 5M	Sigma	71386	Solução de estoque
H2O livre de nuclease	Sigma	W4502	Faça alíquotas de 1 ml em tubos sem nuclease.
		de precipitação de RNA	1,2 M NaCl, citrato de sódio 0,8 M em água livre de nuclease. Prepare-se com antecedência em condições estritamente livres de nuclease. Armazene em temperatura ambiente em tubos de falcão de 50 ml.
Etanol	Sigma	459844	Use com água livre de nuclease para preparar etanol a 80%, armazene a -20 ° C.
1 M Tris Cl livre de nuclease, pH 7,5	Lonza	51237	Solução estoque
500 mM EDTA livre de nuclease, pH 8,0	Invitrogen	15575-020	Solução estoque
10x Tampão de biotinilação (BB)			100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA em água livre de nuclease, faça alíquotas de 1 ml.
Dimetilformamida (DMF)	Sigma	D4551
EZ-Link biotina-HPDP	Pierce	21341	Preparar 1 mg/ml de solução-mãe dissolvendo 50 mg de biotina-HPDP em 50 ml de DMF. O aquecimento suave melhora a solubilização. Armazene a 4 ° C em alíquotas de 1 ml.
Phase Lock Gel Tubos pesados 2,0 ml	Eppendorf	0032 005.152	Opcional para a etapa de extração do clorofórmio.
Membrana Zeta	BIORAD	162-0153
10x Tampão			100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotina-oligo			5'-biotina, 25 nucleotídeos, qualquer sequência
Dodecil sulfato de sódio	Fisher	BPE9738	Para 100 ml de solução estoque a 20%, adicione 20 g de SDS a 80 ml de PBS pH 7-8 e ajuste o volume para 100 ml. Mantenha todas as soluções de SDS de alta porcentagem acima de 20 ° C. Quente as soluções ligeiramente devem precipitar SDS.
EZ-Link Iodoacetil-LC-Biotina	Pierce	21333	Prepare 1 mg/ml de solução-mãe dissolvendo 50 mg de iodoacetil-biotina em 50 ml de DMF. O aquecimento suave melhora a solubilização. Armazene a 4 ° C em alíquotas de 1 ml. Gera biotinilação irreversível e específica para tióis.
Tampão fosfato solução salina	Gibco	10010-015
Tampão			de manchas de pontos Misture 20 ml 20% SDS com 20 ml 1 x PBS pH 7-8 e adicione EDTA à concentração final de 1 mM.
Estreptavidina-rábano peroxidase	Vector	Laboratories SA5004	Armazene a -20 ° C. Misture 10 ml 20% SDS com 10 ml 1 x PBS. Adicione 20 μ l Estreptavidin-HRP antes do uso.
Reagente ECL	GE Healthcare	RNP2109	Use seguindo as instruções do fabricante.
Super RX, Filme X-RA, 18x24 cm	Fujifilm	47410 19236
μ Macs Streptavidin Kit	Miltenyi	130-074-101	Armazene as contas a 4 °C.
Tween 20	Sigma	P1379
Tampão			100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 em H2O. livre de nuclease.
Ditiotreitol (DTT)	Sigma	43817	Preparar como 100 mM DTT em H2O livre de nuclease, preparar sempre fresco antes de utilizar.
Kit RNeasy MinElute	Qiagen	74204	Armazene colunas a 4 ° C, restantes componentes do kit à temperatura ambiente.
Tubos de polipropileno com tampa de rosca de 1,5 ml	Sarstedt	72.692.005	Compatível com tubos de polipropileno com tampa de rosca de 2,0 ml de dimetilformamida
	Sarstedt	72.694.005	Compatível com tubos de dimetilformamida
de 15 ml	BD Falcon	352096	Compatível com tubos de dimetilformamida
de 50 ml	BD Falcon	352070	Compatível com dimetilformamida
Todas as soluções/reagentes devem ser armazenados em temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma.
Equipamento
Espectrofotômetro UV/VIS	Thermo Scientific	NanoDrop 1000	Ou equivalente. Use volume baixo (1-2 μ l) para medições de baixas concentrações de RNA para evitar perda excessiva de amostras.
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml	VWR International	525-0153	Ao contrário dos tubos padrão de 15 ml, estes toleram até 15.000 × g
Centrífuga de alta velocidade	Beckman Coulter	Avanti J-25	Ou equipamento equivalente capaz de atingir 13.000× g
Rotor de alta velocidade	Beckman Coulter	JLA-16250	Ou equipamento equivalente capaz de atingir 13.000× g
Adaptadores para tubos de 15 ml	Laborgerä te Beranek	356964	Ou equipamento equivalente capaz de atingir 13.000× g
Centrífuga de mesa refrigerada	Eppendorf	5430 R	Ou equivalente.
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer compacto	Ou equivalente.
Suporte magnético	Miltenyi Biotec	130-042-109	Um suporte comporta 8 μ Colunas Macs.
Banho de água	Grant	SUB Aqua 5	Ou equivalente.
Escala ultrafina	A& D	GR-202	Ou equivalente.
E-Gel iBase Power System	Invitrogen	G6400UK	Para géis de RNA; ou equivalente.
Géis pré-fabricados de agarose E-Gel EX 1%	Invitrogen	G4020-01	Para géis de RNA; ou equivalente.