acylation הידרוקסיל '2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הבנת תפקידו של רנ"א המעורב בתהליכים ביולוגיים דורשת ידע מעמיק של מבנה RNA. לשם כך, את המתודולוגיה המכונה "acylation הידרוקסיל 2 סלקטיבית תפוקה גבוהה 'נותח על ידי הארכה תחל", או צורה, מאפשרת חיזוי של מבנה המשני RNA עם רזולוציה נוקלאוטיד יחידה. גישה זו מנצלת סוכני חיטוט כימיים שמעדיפים acylate אזורים תקועים או גמישים בודדות של רנ"א בתמיסה מימית. אתרים של שינוי כימי מזוהים על ידי שעתוק הפוך של RNA השונה, ואת המוצרים של התגובה הזו הם מופרדים על ידי אלקטרופורזה נימים אוטומטית (CE). מאז רברס טרנסקריפטאז הפסקות באותם נוקלאוטידים RNA שונה על ידי חומרים כימיים צורה, ספריית cDNA כתוצאה בעקיפין ממפה האלה ribonucleotides שהם תקועים אחת בהקשר של RNA המקופל. באמצעות תוכנת ShapeFinder, המיוצר על ידי את electropherograms האוטומטית לספירה מעובד והוסב לנושולחנות תגובתיות cleotide שהם עצמם הפכו לאילוצים פסאודו אנרגיה בשימוש באלגוריתם חיזוי RNAStructure (V5.3). את מבני RNA דו ממדים המתקבלים על ידי שילוב של SHAPE חיטוט עם בחיזוי מבנה המשני סיליקון ורנ"א כבר נמצא להיות הרבה יותר מדויק מאשר מבנים המתקבלים בשני שיטות לבד.
מבוא
כדי להבין את הפונקציות של RNAs קטליטיים וללא קידוד מעורב בויסות של שחבור, תרגום, שכפול נגיף וסרטן, ידע מפורט של מבנה RNA נדרש 1,2. לרוע המזל, חיזוי מדויק של רנ"א מתקפל מציג אתגר עצום. סוכני חיטוט הקלסיים סובלים מחסרונות רבים כגון רעילות, כיסוי חלקי נוקליאוטידים ו / או תפוקה מוגבלת ל100-150 נוקלאוטידים לכל ניסוי. אלגוריתמים לחיזוי מבנה משניים בכוחות עצמו הם דומה נחות, בשל אי דיוקים הנובעים מחוסר היכולת שלהם להבחין ביעילות בין מבנים אנרגטי דומים. RNAs גדול בפרט הם לעתים קרובות גם עקשן לשיטות של קביעת מבנה 3D כגון קריסטלוגרפיה רנטגן ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, בשל הגמישות שלהם קונפורמציה וכמויות גדולות של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עיצוב פריימר והרחבה של תחנה סופית 'רנ"א 3
כדי לנתח RNAs הארוך על ידי צורת תפוקה גבוהה, סדרה של אתרי הכלאה פריימר צריכה להיות כזה שהם בחרו (אני) מופרדים על ידי ~ 300 NT, (ii) הם 20-30 NT באורך, וכן (iii) כי RNA / הכלאיים DNA המיוצרים על ידי חישול DNA לאתרים האלה יש טמפרטורת התכה צפויה של> 50 ° C. בנוסף, מקטעים של RNA שהם חזו להיות מאוד מובנים יש להימנע, אם כי מה שהופך את קביעה כזו דורשת קצת ידיעה מוקדמת של מבנה רנ"א, אשר לעתים קרובות אינה זמינה. פריימרים DNA שלהכליא לאתרים אלה אז צריכים להיות מתוכננים, מקפידים לוודא שהם לא יהיו צפויים ליצירת הדימרים יציבים או ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
RNA המכיל את רכיב ה-HIV-1 rev התגובה (RRE) ו'3 קלטת מבנה טרמינל 4 הוכנה מפלסמיד לינארית ידי שעתוק במבחנה, אחרי שהיא הייתה מקופלת על ידי חימום, קירור, ודגירה על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של MgCl 2. RNA נחשף לNMIA ולאחר מכן להפוך עיבד מ פריימר 5'-DNA הסוף שכותרתו הכלאה לקלטת מבנה טרמינל 3 '. ספריית cDNA SHAPE כתוצאה מכך, יחד עם תגובות בקרה ורצף, ואז הייתה מופרד באמצעות מערכת Beckman Coulter CEQ 8000 אוטומטי נימי אלקטרופורזה לייצר electrophero.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט עבור צורה של תפוקה גבוהה, טכניקה המאפשרת קביעת מבנה משנית לרזולוצית נוקלאוטיד יחידה לRNAs בכל גודל. יתר על כן, צימוד נתוני צורה ניסיונית עם אלגוריתמים לחיזוי מבנה משניים מאפשר יצירת המודלים 2D RNA עם רמה גבוהה יותר של דיוק מאשר אפשרי עם כל אחת מהשיטות לבד. שילוב של פריימרים fluorescently שכותרת ואוטומטי CE מספק יתרונות משמעותיים על פני הצורה מבוססת ג'ל המסורתית, המאפשר את הרזולוציה של רצפי הרנ"א ארוכים בניסוי אחד, כמו גם מהירות גבוהה יותר באו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
ס Lusvarghi, ג'Sztuba-סולינסקי, KJ Purzycka, ג"ו ראוש וSFJ Le גרייס נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומי לבריאות, ארה"ב.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| N-methylisatoic anhydride (NMIA) | טכנולוגיות חיים | M25 | מתמוססות ב-DMSO |
| נטול מים 1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7) | ראה הפניה 22 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Life technologies 18080044 | 10,000 יחידות | |
| ערכת ריצוף מחזור תרמו | Affymetrix | 78500 | |
| <חזק>חומרים המסופקים על ידי המשתמש | |||
| RNA מעניין | 6 pmol לתגובה (גבול הזיהוי ייקבע על ידי המכשיר) | ||
| סטים של ארבעה פריימרים מסומנים בגודל 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 ו-WellRed D1/Licor IR800) | פריימרים משלימים את ה-RNA ומשמשים בתגובות שעתוק הפוך ורצף. הפלואורופורים הרשומים הם אופטימליים עבור בקמן קולטר 8000 CEQ. ניתן לרכוש או לסנתז פריימרים בבית. | ||
| DNA של תבנית | משמש לריצוף תגובות, וחייב להכיל את רצף ה-RNA הנחקר - כולל כל הרחבה של 3', אם קיימת. במידת הצורך, לעתים קרובות נוח להשתמש בתבנית שעתוק RNA. | ||
| <חזק>מאגרים | |||
| 10x מאגר | 100 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, 1 מ"מ KCl, 1 מ"מ EDTA | ||
| 5X מאגר | 200 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, 25 מ"מ MgCl2, 2.5 מ"מ EDTA, 650 מ"מ KCl. (מאגר זה עשוי להשתנות בהתאם למקרה (למשל pH, מעכב EDTA, Mg, RNase) | ||
| 2.5X RT mix | 4 ו-mu; l מאגר פי 5, 1 μ l 100 מ"מ DTT, 1.5 μ l מים,1 μ l 10 מ"מ dNTPs, 0.5 μ l SuperScript III. שים לב שמאגר 5X ו-100 מ"מ DTT מסופקים עם רכישת SuperScript III (Invitrogen). | ||
| פתרון טעינת דגימות GenomeLab (בקמן קולטר) | <חזק>שימו לב: הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים | ||
| EQUIPMENT | |||
| אלקטרופורזה נימית | בקמן | CEQ8000 | |
| Thermocycler | משתנה |
מקורות
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
