プライマー伸長により解析し、高スループット選択2 'ヒドロキシルアシル化（SHAPE）数百から一塩基の解像度で数千ヌクレオチドRNAの構造を決定するための技術が、逆転写、キャピラリー電気泳動および二次構造予測ソフトウェアをプロービングする新規化学物質を利用しています。
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方法論記事
ハイスループットSHAPEを使用したRNA二次構造予測
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
生物学的プロセスに関与してRNAの機能を理解することは、RNA構造の徹底的な知識が必要です。この終わりに向かって、またはSHAPE "プライマー伸長により解析のハイスループット選択2 'ヒドロキシルアシル化"と呼ばれる方法論は、一塩基分解能を持つRNAの二次構造を予測することができます。このアプローチは、優先的に水溶液中でのRNAの一本鎖またはフレキシブル領域をアシル化する化学プローブエージェントを利用しています。化学修飾部位が修飾されたRNAの逆転写によって検出され、この反応の生成物は、自動化されたキャピラリー電気泳動（CE）によって分画されている。逆転写酵素は、SHAPE試薬によって変更それらのRNAヌクレオチドで一時停止しているため、得られたcDNAライブラリーは、間接的に、単一の折られたRNAの文脈で足止めされているそれらのリボヌクレオチドをマッピング。 ShapeFinderソフトウェアを使用して、自動化されたCEによって生成された電気泳動図はNUに加工と変換される自身がRNAStructure（V5.3）予測アルゴリズムで使用される擬似エネルギー制約に変換されcleotide反応テーブル。 シリコ RNAの二次構造予測でプロービングSHAPEを組み合わせることにより得られる二次元RNA構造は単独の方法を用いて得られた構造体よりもはるかに正確であることが見出されている。
概要
スプライシング、翻訳、ウイルス複製および癌の調節に関与する触媒と非コーディングRNAの機能を理解するために、RNAの構造の詳細な知識が必要である1,2。残念なことに、RNA折りたたみの正確な予測は手ごわい課題を提示。クラシックプロービングエージェントは実験当たり100-150ヌクレオチドに限定され、このような毒性など多くの欠点から不完全なヌクレオチドカバレッジおよび/またはスループットに苦しむ。肉眼二次構造予測アルゴリズムは、効果的に精力的に類似した構造を区別することができないことに起因する不正確さに起因し、同様に不利である。特に大規模なRNAは、また、それらのコンフォメーションの柔軟性と、これらの技術に必要な高純度の試料を大量に起因するX線結晶構造解析と核磁気共鳴（NMR）分光法、などの3D構造決定の方法にしばしば難治性である。
HIGHスループットのSHAPEは、単一ヌクレオチド解像度で大RNAの構造をプロービングする効果的な、単純なアプローチを提供することによってこれらの問題の多くを解決する。また、SHAPEに使用される試薬は、取り扱いが安全で容易であり、試薬をプロービング他のほとんどの化学物質とは対照的に、すべての4つのリボヌクレオチドと反応する。これらの試薬 はまた、 インビボ可能コンテキスト （複数可）3 でその中にRNAを精査すること、細胞膜を貫通することがで....
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プロトコル
RNAの3 '末端のプライマーの設計と拡張
ハイスループットSHAPEにより長いRNAを分析するために、プライマーハイブリダイゼーション部位一連のは、それらが（i）は〜300ヌクレオチドによって分離されるように選択されるべきであること、（ii）長さ20〜30ヌクレオチドであり、および（iii）そのRNA /これらのサイトにDNAをアニーリングにより生成さDNAハイブリッドは> 50℃での予想される融解温度を有するこのような判定を行うことがしばしば利用できないRNA構造のいくつかの予知を必要とするが、また、高度に構造化されると予測されるRNAのセグメントは、避けるべきである。これらの部位にハイブリダイズするDNAプライマーはそれらが安定した二量体又は鎖内の二次構造を形成することが期待されないように注意しながら、設計されるべきである。
一度設計し、プライマーセットのいずれかをご購入された（統合DNAテクノロジー、エイムズ、アイオワ州からなど ）または24,25を合成する必要があります。プライマー5'-Cy5標識、Cy5.5のと、WellRedD2（ベックマン·コールター）とIRDye800（Lycor）/ WellRedD1（ベックマン·コールター）は最高のクロストークを最小限に抑えながら、優れた信号強度を提供し、ベックマン·コールター8000 CEQに適しています。標識され....
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結果
RNAは存在下でHIV-1回転応答エレメント（RRE）および3 '末端構造カセット4は 、それが 37℃で加熱、冷却、およびインキュベーションによって折られた後に、in vitro転写により線状プラスミドから調製した°Cを含有するのMgCl 2。 RNAはNMIAに露出した後、3 '末端構造カセットにハイブリダイズした5'-末端標識DNAプライマーから逆転写。得られたcDNAライブラリーSHAPEは、一緒に制御し、配列決定反応と、その後、 図4に示す電気泳動図を生成するためにベックマン·コールターCEQ 8000自動化されたキャピラリー電気泳動システムを用いて分画した。以下のように4重なり、色分けされたトレースは、キャピラリを介して反応生成物の4組の移動によって生成される：ブルー（NMIA変性RNAの逆転写から生成Cy5で標識したRT製品）、緑色（Cy5.5の標識化折り畳まれたが、それ以外unmodifiからRT製品EDセンスRNA）、ブラック（DDGを使用して生成WellRed D2-標識した.......
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ディスカッション
我々はここで高スループットSHAPEの詳細なプロトコルがあるどの規模のRNAのための一塩基の解像度に二次構造の決定を可能にする手法を提示する。また、二次構造の予測アルゴリズムを実験SHAPEデータを結合するだけではどちらの方法で可能であるよりも高精度にRNA二次元モデルの生成を容易にする。蛍光標識されたプライマーと自動CEの組み合わせは、単一の実験で長いRNA配列の解決を促進する従来のゲルベース図形の上に大きな利点、ならびに複数の実験のために実質的により高い速度とスループットを提供します。適切なデータ解析ツールは、この方法と可用性の便宜は、以前は難治ウイルス、そのままメッセンジャー、および非コードRNAの構造解析のために理想的に適して形を作る。これらの魅力的なRNAの二次元構造が明確になるように、ヒドロキシルラジカルの使用はスルースパ、プロービングCE切断方法論と分子モデリングは、複雑な三次相互作用を解明し、最終的に研究者が三次元でこれらのRNAの構造を決定できるように支援する必要があります。
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開示事項
利害の衝突は宣言されていない。
謝辞
S. Lusvarghi、J. Sztuba-Solinska、KJ Purzycka、JWラウシュとSFJル·グライスは、国立癌研究所、国立衛生研究所、米国の学内研究プログラムによってサポートされています。
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材料
EQUIPMENT
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| N-メチルイサトイック無水物 (NMIA) | ライフテクノロジー | M25 | 無水DMSO |
| 1-メチル-t-ニトロイサト酸無水物 (1M7) | 参照22 | ||
| Superscript III 逆転写酵素 | ライフテクノロジー | 18080044 | 10,000ユニット |
| サーモシーケンナーゼサイクルシーケンシングキット | Affymetrix | 78500 | |
| Materials provided by the user | |||
| RNA of interest | 6 pmol per reaction (検出限界は装置によって決定されます) | ||
| 4つの5'標識プライマーのセット(Cy5、Cy5.5、WellRed D2、WellRed D1/Licor IR800) | プライマーはRNAに相補的であり、逆転写反応やシーケンシング反応に使用されます。記載されている蛍光色素は、ベックマン・コールター8000 CEQに最適です。プライマーは、社内で購入または合成することができます。 | ||
| DNAテンプレート | DNAは、シーケンシング反応に使用され、研究対象のRNAの配列(存在する場合は任意の3'末端伸長を含む)を含んでいなければなりません。該当する場合は、RNA転写テンプレートを使用すると便利なことがよくあります。 | ||
| Buffers | |||
| 10x RNA renaturation buffer | 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA | ||
| 5X RNA フォールディングバッファー | 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (このバッファーは、ケース（例:pH、 EDTA、Mg、RNase阻害剤) | ||
| 2.5X RTミックス | 4 μl 5X バッファー、1 μl 100 mM DTT、1.5 &μ;l 水、1 μl 10 mM dNTP、0.5 &μ;l 上付き文字 III.5X バッファーと 100 mM DTT は、SuperScript III (Invitrogen) を購入すると提供されます。 | ||
| GenomeLab サンプルローディングソリューション (ベックマン・コールター) | Attention: 複数の凍結融解サイクルを避ける< | ||
| キャピラリー電気泳動 | ベックマン | CEQ8000 | |
| サーモサイクラー | はさまざまです |
参考文献
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.....
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再版と許可
