Вакуоли и цитозольных рН может быть измерена в живых дрожжей ( С. CEREVISIAE) При использовании логометрического флуоресцентных красителей локализованы в конкретных клеточных компартментах. Опишем процедуры измерения рН вакуоли с BCECF-AM, который локализуется в вакуоль у дрожжей и цитозольных рН с цитозольного логометрических рН-чувствительных GFP (дрожжи pHluorin).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение и вакуолярных Цитозольные рН
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вакуоли и цитозольных рН строго регулируется в клетках дрожжей и занимают центральную роль в гомеостазе общий рН. Мы описываем протоколы для радиометрические измерения рН в естественных условиях использования рН-чувствительных флуорофорам локализован в вакуоль или цитозоль. Вакуоли рН измеряли с использованием BCECF, который локализуется в вакуоль в дрожжах при введении в клетки в ацетоксиметил форме сложного эфира. Цитозольного рН измеряли с помощью рН-чувствительных GFP экспрессировался под контролем промотора, дрожжи, дрожжевой pHluorin. Методы измерения флуоресценции соотношений в дрожжевой клетке суспензий на флуориметре описаны. С помощью этих протоколов, один момент времени измерения рН в разных условиях и в разных мутантов дрожжей сравнением и изменения рН в течение долгого времени был проведен мониторинг. Эти методы также были адаптированы к флуоресцентным планшет-ридере формат высокой пропускной экспериментов. Преимущества радиометрические измерения рН по сравнению с другими APподходы используются в настоящее время, потенциальные экспериментальные проблемы и решения, а также перспективы для будущего использования этих методов также описаны.
Введение
рН гомеостаза является динамичной и строго регулируется процесс во всех 1,2 организмов. Биохимические процессы жестко регулируется рН и внутриклеточной среды настроены на узких диапазонах рН для оптимальной деятельности резидента ферментов. Однако гомеостаз внутриклеточного рН может быть оспорена быстрых изменений в рН среды, метаболические сдвиги, и определенные сигнальные пути. Кроме того, внутриклеточный рН сам по себе может служить в качестве важного сигнала. Наконец, многие органеллы поддержания просвета значениях рН, которые отличаются от окружающих цитозоль и необходимым для органелл конкретных функций.
Дрожжей Sacch....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Измерение рН вакуолярных In Vivo Использование BCECF-AM
- Grow 50 мл жидкой культуры штамма дрожжей должна быть измерена в нужном среде в течение ночи. Цель состоит в том, чтобы иметь клеток в середине логарифмической фазы (OD 600 (оптическая плотность при 600 нм) измерение примерно 0,8 суспензии).
- Гранул дрожжевые клетки центрифугированием. Ресуспендируют осадок в 0,6 мл среды роста и передачи в микроцентрифужных трубки, которая была предварительно взвешенный. Осаждения клеток снова в микроцентрифужных при 2000 мкг в течение 60 сек. Удалить супернатант настолько полно, насколько это возможно, и затем взвесить осадок клеток. Ресуспендир....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
1 приведены данные вакуоли рН полученных на дрожжей дикого типа клеток, выращенных в обогащенной среде (дрожжевой экстракт-пептон-декстраном; YEPD), забуференном до рН 5 с помощью 50 мМ MES. Мы часто выращивать клетки в буферной среде, поскольку рН среды может резко измениться в течение ночи роста, в частности на минимальной среде, и было обнаружено, что величина рН питательной среды может повлиять вакуоли ответов рН 3. Тем не менее, это также приемлемо для многих экспериментов расти клеткам .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы использовали эти протоколы для решения ряда аспектов рН гомеостаза. Например, мы сравнивали цитозольного и рН реакции дикого типа и V-АТФазы с дефицитом мутантных клеток 4,5. Мы также исследовали влияние изменившихся условий роста, в частности рН внеклеточной, на вакуолярных ответа рН до глюкозы 3. Важно отметить, что ответы, которые мы наблюдаем оба согласуются с другими методами количественного измерения рН и с биохимическими данными, описывающими измененных деятельностью протонного насоса.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH R01 GM50322 в PM Кейна. Авторы благодарят доктора Раджини Рао, Университет Джона Хопкинса за предоставление дрожжей pHluorin плазмид и для рекомендаций по радиометрические измерения рН, и д-р Глория А. Мартинес Муньос для разработки этих протоколов для нашей лаборатории.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Спектрофлуориметр | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Желательна возможность контроля температуры и перемешивания. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Приготовьте бульон 12 мМ в сухом ДМСО, храните в виде аликвот при температуре -20 °°С; C |
| monensin | Sigma | M5273 | Токсичный. |
| нигерицин | Sigma | N7143 | Токсичный. |
| MES | Sigma | M8250 |
Ссылки
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
