可以使用定位于特定细胞区室的比率型荧光染料，在活体酵母（S. cerevisiae）细胞中测定液泡和细胞质的pH值。本文描述了利用BCECF-AM测定液泡pH的方法，该染料可定位于酵母液泡中；同时介绍了利用细胞质定位的比率型pH敏感性GFP（酵母pHluorin）测定细胞质pH的步骤。
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摘要
摘要
酵母细胞中的液泡和细胞质 pH 值受到高度调控，在整体 pH 稳态中占据核心地位。本文描述了利用定位于液泡或细胞质的 pH 敏感染料，通过比率法在活体内（in vivo）测量 pH 的实验方案。液泡 pH 值的测定采用 BCECF，该染料以乙酰甲氧基酯形式引入酵母细胞后可定位于液泡。细胞质 pH 值则通过在酵母启动子控制下表达的 pH 敏感型绿色荧光蛋白酵母 pHluorin 进行测定。文中还介绍了在荧光分光光度计中对酵母细胞悬液的荧光比率进行测量的方法。通过这些方案，已对不同条件下或不同酵母突变体中的 pH 值进行了单时间点比较，并实现了对 pH 值随时间变化的动态监测。这些方法还已被适配用于荧光酶标仪平台，以支持高通量实验。本文同时阐述了比率法 pH 测量相较于当前其他方法的优势、可能遇到的实验问题及其解决方案，以及这些技术的未来应用前景。
引言
pH 稳态是所有生物体中一种动态且高度调控的过程1,2。生物化学过程受到 pH 的严密调控，细胞内环境被调节至狭窄的 pH 范围，以确保其内酶类发挥最佳活性。然而，细胞内 pH 稳态可能受到环境 pH 的快速变化、代谢转变以及某些信号通路的挑战。此外，细胞内 pH 本身也可作为一种重要的信号。最后，许多细胞器维持着与其周围细胞质不同的腔内 pH 值，这对于细胞器特异性的功能至关重要。
酵母Saccharomyces cerevisiae与高等真核生物共享多种pH稳态机制2。在内吞/溶酶体途径的酸性细胞器中，pH主要由高度保守的液泡质子转运ATP酶（V-ATPase）调控，该酶与多个依赖pH梯度的交换蛋白协同作用。所有真核细胞还具有质子外排机制。在真菌和植物中，细胞质膜上存在第二种独特的质子泵Pma1，可外排代谢产生的质子，被认为是细胞质pH和质膜电位的主要决定因素。S. cerevisiae的遗传可塑性及其商业重要性使其成为研究pH稳态的一个非常有趣且重要的模型2。
除了作为细胞器酸化的主要驱动因素外，V-ATPase 还是一类高度受调控的酶，本实验室致力于研究 V-ATPase 调控的分子机制。为实现这一目标，我们一直采用 体内 液泡和细胞质pH值的测定：1）监测细胞对胞外环境变化（如葡萄糖剥夺与重新添加）的响应；2）研究影响V-ATP酶活性的突变所造成的影响；3）探讨细胞器与质膜质子泵之间的协同作用 3-5这些实验之所以成为可能，仅得益于适用于酵母细胞的稳定比率型pH指示剂的发展。植物 等 首次发现BCECF（2'7'-双(2-羧乙基)-5-(和6)-羧基荧光素）——一种广泛用于测定哺乳动物细胞胞质pH的染料——在酵母液泡中积累，而非胞质中 6这种BCECF定位的差异归因于液泡内存在的多种水解酶，这些酶可能负责将BCECF-AM（BCECF的乙酰氧基甲酯）上的乙酰氧基甲酯基团切除，从而导致BCECF在液泡内的滞留 6. Ali 等 7 进一步开发了使用BCECF进行液泡pH值测量的方法，并将这些测量适配于荧光酶标仪格式。Brett 等 引入酵母pHluorin，通过表达质粒携带的比率型pH敏感性GFP来测定酵母细胞质pH 8 在酵母特异性启动子的调控下 9.
BCECF 和酵母 pHluorin 的激发光谱均对 pH 敏感，因此被用作比率型 pH 指示剂，其原理是在单一发射波长下测量两个激发波长处的荧光强度比值，从而反映 pH 水平8,10。这些用于酵母液泡和细胞质的 pH 传感器已被广泛应用于单细胞及群体水平的测量。单细胞测量6,11通过荧光显微镜结合图像分析完成，对每个细胞分别测定两个波长下的液泡或细胞质荧光强度。群体水平的测量则可在具备适当荧光检测功能的微孔板读板仪或荧光分光光度计中进行。我们通常在荧光分光光度计中进行测量，因其便于在连续动力学检测过程中添加葡萄糖等组分。下文列出了本实验室当前用于测定液泡和细胞质 pH 的实验方案；这两种方法均可轻松适用于微孔板检测。
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方案
1. 液泡pH值的测定 在体 内 使用 BCECF-AM
- 在所需培养基中过夜培养50 ml酵母菌株液体培养物。目标是使细胞处于对数生长中期（悬浮液在600 nm处的光密度OD600约为0.8）。
- 通过离心收集酵母细胞。将沉淀重悬于0.6 ml培养基中，并转移至已预先称重的微量离心管中。在微量离心机中以2,000 × g离心60秒，再次收集细胞。尽可能彻底去除上清液，然后称量细胞沉淀。将沉淀重悬至终浓度为0.5 g/ml（w/v）；该体积的培养物可获得约200 mg的细胞沉淀，加入200 μl缓冲液后终体积为400 μl。
- 向细胞悬液中加入BCECF-AM，使其终浓度为50 mM（使用DMSO配制的12 mM储备液）。充分混匀后，在30 °C下于摇床或滚轴仪上孵育30分钟。
- 在细胞孵育期间，配制校准缓冲液。校准缓冲液包含50 mM MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）、50 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）、50 mM KCl、50 mM NaCl、0.2 M醋酸铵、10 mM叠氮化钠和10 mM 2-脱氧葡萄糖，用NaOH或HCl调节至适合校准范围的pH值。（注意：叠氮化钠具有高毒性，操作时应小心。）对于野生型细胞的pH测定，我们通常配制pH 5.5至6.5范围内的多种校准混合液；而对于预期液泡pH更高（更偏碱性）的突变株（如vma突变株），则需额外配制更高pH的缓冲液。
- 将每种pH值的校准缓冲液各2 ml分装至15 ml锥形管中，加入莫能菌素（15 mM储备液）和尼日利亚菌素（2 mM储备液），使其终浓度分别为110 μM和15 μM。在涡旋振荡器上充分混匀。（注意：莫能菌素和尼日利亚菌素均有毒性，操作时应小心。）
- BCECF-AM孵育结束后，在微量离心机中以2,000 × g离心30秒收集细胞悬液。将细胞重悬于1 ml不含葡萄糖的培养基中，并按上述条件离心。重复洗涤一次，然后将沉淀重悬于200 μl不含葡萄糖的培养基中，置于冰上。
- 取20 μl细胞悬液加入上述各pH值的校准管中。在30 °C下于滚轴仪上孵育30–60分钟。
- 将荧光分光光度计设置为交替激发波长450 nm和490 nm，发射波长均为535 nm。将样品室温度设为30 °C。所有测量均需在比色皿中持续搅拌混合液的条件下进行。
- 加入1.96 ml 1 mM MES（根据细胞培养基的pH及实验设计，调节至pH 5或7）。向比色皿中加入20 μl细胞悬液，启动荧光测定。我们在不同实验中分别采集连续动力学数据和时间点数据。对于连续动力学数据，每6秒采集一次，持续5分钟，然后加入葡萄糖至终浓度50 mM，继续测量5–10分钟。对于单时间点测量，通常在细胞加入比色皿后1分钟和5分钟时各测一次，按动力学实验方法加入葡萄糖，再于加糖后5分钟进行另一次测量。这些添加步骤可根据需要调整，也可加入其他组分（如抑制剂等）。
- 实验测量完成后，将校准管从30 °C孵育环境中取出，将每管全部2 ml溶液转移至荧光分光光度计的比色皿中。在相同仪器设置下（见步骤1.8），每5秒测量一次荧光值，每样本共测量30秒。
- 将荧光数据导出至Microsoft Excel。（对于我们的荧光仪，需以制表符分隔的文本格式导出并导入Excel。）通过计算每种校准混合液在490 nm与450 nm处的荧光强度比值，获得校准曲线。将荧光比值对pH作图，得到校准曲线。
- 将实验数据转换为荧光比值，并利用标准曲线计算pH值。随后可将液泡pH对时间作图（pH变化的动力学曲线），或在不同条件（图1）或不同突变株之间进行比较。
2. 细胞质pH的测定 活体（In Vivo） 使用酵母pHluorin
- 按照标准方案将目标酵母菌株转化含有酵母pHluorin质粒的载体，并在缺乏尿嘧啶的补充性最低培养基（SC-尿嘧啶）上筛选转化子。
- 在SC-尿嘧啶液体培养基中培养50 ml转化后的细胞，至对数生长中期（OD600 = 0.8或更低）。
- 按照液泡pH测定所述方法制备校准标准品，但将缓冲液调节至适用于细胞质pH测定的pH范围，通常为pH 6–8。将调节至目标pH值的校准缓冲液各2 ml分装至若干15 ml锥形管中。按前述方法（1.4）加入莫能菌素（monensin）和尼日尔菌素（nigericin），充分混匀。
- 按前述方法通过离心收集细胞，将沉淀重悬于600 μl培养基中。转移至已称重的微量离心管中，在5,000 rpm下离心30秒以收集细胞沉淀。用不含葡萄糖的培养基（SC-尿嘧啶，-葡萄糖）将沉淀重悬1 ml，再次离心收集细胞，并重复一次。最后一次离心后，尽可能彻底地移除上清液，称量细胞沉淀重量。将细胞重悬于不含葡萄糖的SC-尿嘧啶培养基中，调整终浓度为0.5 g/ml。
- 向每管校准缓冲液中加入20 μl细胞悬液，使用涡旋振荡器充分混匀。在30 °C下于旋转滚筒摇床中孵育60分钟。
- 设置荧光分光光度计，激发波长分别为405 nm和485 nm，发射波长为508 nm。按照BCECF测定所述方法进行单时间点或动力学测量，并加入葡萄糖。
- 测定各校准样品的荧光值，参照BCECF方法绘制校准曲线（见1.10–1.11）。在大多数细胞质pH测定范围内（pH 6.0–8.0），荧光比值与pH之间的关系呈线性9，因此实验测得的荧光比值可直接转换为pH值。
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结果
图1展示了在富含培养基（酵母提取物-蛋白胨-右旋糖；YEPD）中培养的野生型酵母细胞的液泡pH数据，该培养基用50 mM MES缓冲至pH 5。我们通常将细胞培养在缓冲培养基中，因为在过夜培养期间，培养基的pH值可能会发生显著变化，尤其是对于最小培养基，我们发现生长培养基的pH值会影响液泡pH的响应3。然而，对于许多实验而言，在未缓冲的培养基中培养细胞也是可接受的。图1A显示了按照上述方案用BCECF-AM孵育细胞后得到的校准曲线。尽管BCECF荧光比值与液泡pH在较宽pH范围内呈非线性关系7，但在本实验测量的相关范围内几乎呈线性，因此显示并使用线性趋势线来计算实验中的pH值。图1B展示了向葡萄糖缺乏的细胞中添加葡萄糖后引起的液泡pH变化。在BCECF-AM标记过程中，由于细胞缺乏葡萄糖，液泡pH升高；而在重新添加葡萄糖后，液泡pH下降，推测这是由于V-ATP酶通过重新组装而被激活所致3,4。在添加葡萄糖后三分钟加入50 mM KCl时，观察到液泡pH略有上升。在较大规模...
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讨论
我们已利用这些方案研究了pH稳态的多个方面。例如，我们比较了野生型细胞与V-ATPase缺陷型突变细胞的胞质和液泡pH响应4,5。我们还考察了不同生长条件（尤其是细胞外pH）对葡萄糖诱导的液泡pH响应的影响3。重要的是，我们观察到的响应结果与其他定量pH测定方法以及描述质子泵活性变化的生物化学数据均一致。
两种类型最重要的两个特征 体内 此处所述的pH测量依赖于荧光探针的定位及其信号强度；若其中任一方面存在问题，则需针对特定应用或突变体对方法进行修改。BCECF的液泡定位在一定程度上是偶然的 6，但在多种不同的突变体中得以保留，包括 vma 突变体 4，其液泡水解酶水平降低。利用微分干涉差显微镜（Nomarski光学系统）可清晰观察酵母液泡，我们证实了每种菌株中染料的液泡定位。pHluorin作为pH传感器更具多功能性，尤其因其在大部分生理pH范围内均有响应图2A). 我们所使用的酵母pHluorin似乎仅定位于细胞质，这可能...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM50322 项目资助，授予 P.M. Kane。作者感谢约翰斯·霍普金斯大学 Rajini Rao 博士提供酵母 pHluorin 质粒，并在比率法 pH 测量方面提供指导，同时感谢 Gloria A. Martinez Munoz 博士为本实验室优化这些实验方案。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光分光光度计 | Horiba Jobin Yvon | 型号 Fluoromax-4 | 建议具备温度控制和搅拌功能。 |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | 用无水DMSO配制成12 mM的储存液，分装后于-20 °C保存 |
| 莫能菌素 | Sigma | M5273 | 有毒。 |
| 尼日菌素 | Sigma | N7143 | 有毒。 |
| MES | Sigma | M8250 |
参考文献
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939(2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619(2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
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