液胞と細胞質のpHの測定<emインビボで&gt;</em&gt;酵母細胞懸濁液に

サマリー

液胞と細胞質のpHは生酵母で測定することができる（ S.セレビ）特定の細胞区画に局在レシオメトリック蛍光色素を用いて細胞。我々は、酵母における液胞に局在BCECF-AM、および細胞質レシオメトリックpH感受性GFP（酵母pHluorin）と細胞質のpHと液胞のpHを測定するための手順について説明します。

要約

液胞および細胞質ゾルのpHは非常酵母細胞で規定さおよび全体のpHホメオスタシスにおいて中心的な役割を占めるている。私たちは、液胞や細胞質に局在するpH感受性蛍光プローブを用いたin vivoでのpHのレシオメトリック測定のためのプロトコルを記述します。液胞pHは、そのアセトキシメチルエステルの形態で細胞に導入する際に、酵母液胞に局在BCECFを用いて測定される。細胞質ゾルのpHは、酵母プロモーターの制御下で発現pH感受性GFP、酵母pHluorinで測定される。蛍光中の酵母細胞懸濁液中の蛍光比の測定のための方法が記載されている。これらのプロトコルを介して、さまざまな条件の下で、または異なる酵母変異体のpHの単一時点の測定が比較され、経時的なpHの変化が監視されている。これらの方法は、高スループット実験のための蛍光プレートリーダーフォーマットに適応されている。他のAP上のレシオメトリックpH測定の利点現在使用され、潜在的な実験的な問題と解決策、およびこれらの技術の将来の使用のための見通しに近づくにつれても記載されている。

概要

pHの恒常性は、すべての生物^1,2の動的かつ高度に調整されたプロセスである。生化学的プロセスは厳密にpH値によって規制されており、細胞内の環境が常駐酵素の最適な活性を可能にするために狭いpH範囲に同調される。しかし、細胞内pHの恒常性は、環境pHの急激な変化、代謝シフト、および特定のシグナル伝達経路によって挑戦することができます。また、細胞内のpHが重要なシグナルとしての地位を提供することができます。最後に、多くの細胞小器官は、周囲の細胞質は異なるとオルガネラ固有の機能に不可欠である内腔pH値を維持します。

酵母サッカロミセス·セレビシエ株高等真核生物²でpHの恒常性メカニズムの数。リソソーム/エンドサイトーシス経路の酸性オルガネラにおいて、pHは、主に多くのexchanと連携して作用する、高度に保存された液胞プロトンATPアーゼ転位（V-ATPアーゼ）によって制御されるpH勾配に依存ジェール。すべての真核細胞は、またプロトンエクスポートメカニズムを持っています。菌類や植物、形質膜の第二、別個のプロトンポンプ、PMA1、輸出プロトン代謝および細胞質のpHおよび細胞膜電位の主要な決定要因であると考えられている。 S.の遺伝的柔軟性出芽酵母とその商業的重要性は、それのpHホメオスタシス^2を研究するための非常に興味深く、重要なモデルました。

オルガネラの酸性化の主な要因であることに加えて、V-ATPアーゼは、高度に規制された酵素であり、私たちの研究室では、V-ATPaseの調節のメカニズムを理解することに興味があります。この目標に向かって、私たちは、液胞と細胞質のpHの生体内 pH測定に使用してきました：1）変異の影響その妥協V-ATPアーゼ活性を調べるためにこのようなグルコース欠乏とreaddition、2などの変化外条件）への応答を監視するために、及び3）COORを探索するオルガネラと細胞膜プロトンポンプ^3-5 dination。これらの実験は、酵母細胞での使用に適して堅牢なレシオメトリックpH指示薬の開発によって可能になった。 （ - （および6） -カルボキシフルオレセイン2'7'-ビス- （2 -カルボキシエチル）-5）、哺乳動物細胞において細胞質ゾルのpHを測定するために広く使用されている、酵母液胞に蓄積植物らは最初BCECFことを示した代わりに、細胞質ゾル^6。 BCECFのローカライズにおけるこの差はおそらくBCECF-AM（BCECFのアセトキシメチルエステル）と液胞の保持⁶からアセトキシメチルエステルの開裂を担当する液胞の多くの加水分解酵素、に起因している。アリら ^7は、さらに^、BCECFを使用して、液胞pH測定を開発し、蛍光プレートリーダー形式にこれらの測定値を適合。プラスミド媒介Rを発現させることにより酵母の細胞質のpHを測定する手段としてブレットら導入された酵母pHluorinatiometric pH感受性酵母特異的プロモーター⁹の制御下にGFP ^8。

BCECFおよび酵母pHluorin両方の励起スペクトルは、pHに敏感であるので、それらは単一の発光波長で測定された2つの励起波長での蛍光の割合でレシオメトリックpH指示薬として使用され、pHが^8,10の尺度を提供する。これらの酵母液胞および細胞質ゾルのpHセンサは、シングルセルおよび人口ベースの測定のために使用されている。単一セルの測定は^6,11蛍光顕微鏡と画像解析によって行われる。二つの波長における液胞または細胞質蛍光はセル毎に測定する。集団ベースの測定は、適切な蛍光機能を備えたマイクロプレートリーダーのいずれかで、または蛍光で実行されます。それは詐欺中グルコースなどのコンポーネントを追加するための簡単​​なアクセスを提供するため、我々は一般的に、蛍光で我々の測定を行っている連続運動測定。液胞および細胞質ゾルのpHの測定のための我々の現在の実験プロトコルは以下の通りです。両方も容易にマイクロプレートアッセイに適合される。

プロトコル

1。 BCECF-AMを用いたin vivo において、液胞のpHの測定

1. 一夜希望の媒体中で測定する酵母菌株を50mlの液体培養を育てる。目標は、中期対数期（OD600（600nmでの光学密度）が約0.8サスペンション用の測定）で細胞を有することである。
2. 遠心分離によりペレット酵母細胞。増殖培地、以前に秤量されたマイクロチューブへの転送0.6ミリリットルでペレットを再懸濁します。ペレット60秒間2,000 xgで遠心で再び細胞。として完全に可能な限り上清を除去した後、細胞ペレットを量る。このボリュームの培養物は、約200ミリグラムの細胞ペレットを与える、バッファ200μlを400μlの最終容量を得るために添加されるだろう。0.5グラム/ミリリットル（w / v）の最終濃度にペレットを再懸濁する。
3. DMSOで準備12mMのストックからの50mMの最終濃度で細胞懸濁液にBCECF-AM追加。よく混ぜた後、株式会社30分間30℃で細胞をubate。ロッキングプラットフォームまたはローラードラム上。
4. 細胞がインキュベートされていますが、キャリブレーション·バッファを準備します。 、50mMのHEPES（4 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸）、50mMのKClを、50mMのNaCl、0.2 M酢酸アンモニウム、 - 較正緩衝液は50mMのMES（（N-モルホリノ）エタンスルホン酸2）を含有10mMのアジ化ナトリウム、および10mM 2 - デオキシグルコース、及びpHに調整されては、NaOHまたはHClであなたの校正範囲の適切な値。 （警告：アジ化ナトリウムは非常に毒性があり、慎重に扱われるべきである）は、野生型細胞内のpHの測定のために、我々はpHが5.5から6.5に複数のキャリブレーション混合物を準備しますが、より多くのアルカリ性の液胞のpHを有することが期待変異のために（ VMA変異体）、我々は追加の、より高いpH緩衝剤を調製だろう。
5. アリコート2 15 mlコニカルチューブに各pH値の校正バッファmlの、そして最後の110μMのモネンシンの濃度及び15μMニゲリシン、Rを与えることモネンシン（15 mMストック）とナイジェリシンを（2 mMストック）を追加espectively。ボルテックスミキサーでよく混ぜる。 （注意：モネンシンとナイジェリシン両方が有毒であり、慎重に処理する必要があります。）
6. マイクロ2,000 xgで30秒間遠心分離によりBCECF-AMのインキュベーション時間が終了すると、ペレット細胞懸濁液。細胞を再懸濁し、上記のように、グルコースと遠心分離機を欠く増殖培地1mlのです。一度この洗浄ステップを繰り返し、その後、グルコースなしで増殖培地200μlのペレットを再懸濁します。氷の上に置きます。
7. 上記調製した各pHの校正チューブに細胞懸濁液20μlを追加します。 30-60分間30℃でインキュベートする。ローラードラム上。
8. 交互に励起波長450 nmおよび490 nmの535 nmでの発光波長との両方で測定するための蛍光を設定します。 30℃に試料室の温度を設定するキュベット内の混合物を連続的に撹拌しながら、すべての測定を実行します。
9. 細胞の増殖培地のpHに応じてpHを5〜7に調整した1mMのMES（の1.96ミリリットルを追加するND実験計画）。キュベットに細胞懸濁液20μlを追加します。蛍光測定を開始します。我々は継続的な運動と異なる実験の時間のポイントデータの両方を収集します。連続した運動データのために、我々は5分間毎に6秒の測定を行い、その後の50mMの最終グルコース濃度にブドウ糖を追加し、5〜10分間の測定を継続する。単一の時点を測定のために、我々は一般的に1〜5分で測定を行う。キュベットへの細胞の添加後、運動の測定と同様にグルコースを追加し、他の測定5分かかる。グルコース添加後。これらの添加を変化させることができ、追加の成分（阻害剤等）を添加することもできる。
10. 実験測定が完了した後、30℃のインキュベーションからキャリブレーションチューブを取り外し、蛍光のキュベットにそれぞれのための全体の2 mlのボリュームを転送します。すべての5秒は、各サンプルのために30秒の合計にわたって同じ設定（1.8を参照）での蛍光を測定します。
11. Microsoft Excelに蛍光データをエクスポートします。 （我々の蛍光は、これはExcelにタブ区切り形式およびインポートでテキストとしてデータのエクスポートが必要です。）各キャリブレーション混合物のために450 nmの490 nmでの蛍光の比率を計算することにより、検量線を取得します。蛍光比は、その後、検量線を得るためにpH値に対してプロットされている。
12. 蛍光比に実験データを変換し、標準曲線を用いてpH値を計算します。液胞pHを、時間に対してプロット（pH変化の動態）や各種条件（ 図1）に基づいて、または異なる変異株で比較したができる。

2。酵母pHluorinを用いたin vivo で細胞質のpHの測定

1. 標準プロトコルによってプラスミド酵母pHluorinで所望の酵母株を形質転換し、補完最小培地欠けウラシル（SC-ウラシル）で形質転換体を選択する。
2. 中期対数期（ODにSC-ウラシルで形質転換細胞を50mlの液体培養を育てる 600 = 0.8以下）。
3. 液胞のpHが、一般的に細胞質pH測定、pHは6-8のための適切なpH範囲のバッファーで説明した校正標準を準備します。キャリブレーション·バッファのアリコート2ミリリットルは、いくつかの15ミリリットルコニカルチューブに所望のpHに調整した。 （1.4）上記のようにモネンシンとナイジェリシンを加え、よく混ぜる。
4. 上記のように遠心分離によって細胞を回収し、増殖培地600μlのでペレットを再懸濁します。 30秒間5,000 rpmで遠心分離することにより体重マイクロチューブ、ペレット細胞に移す。再びグルコース（SC-ウラシル、-グルコース）、細胞をペレット化することなく、増殖培地1mlにペレットを再懸濁し、繰り返す。最後の遠心分離の後、可能な限り徹底的に上清を除去し、細胞ペレットを量る。無グルコースとSC-ウラシルで0.5グラム/ mlの最終濃度に細胞を再懸濁します。
5. キャリブレーション·バッファの各チューブに細胞懸濁液20μlを加え、ボルテックスミキサーでよく混ぜる。 3でインキュベート0℃で60分間回転ドラムロータ上のC。
6. 波長405および485 nmで励起し、508 nmでの発光波長蛍光を設定します。 BCECF測定のために上述したように、単一の時点または運動の測定およびグルコースの添加を進める。
7. キャリブレーションサンプルの蛍光を測定し、BCECF（1.10から1.11を参照）として検量線を作成する。蛍光比対pH値のプロットは、ほとんどの細胞質pH測定液（pH ^{6.0〜8.0）9}の範囲にわたって線形であるため、実験的な蛍光比の測定が容易にpHに変換される。

結果

50mMのMESでpH5に緩衝、 図1には、リッチメディア（YEPD酵母エキスペプトン-デキストラン）で栽培された野生型酵母細胞上で得られる液胞pHのデータを提示します。培地のpHは、特に最少培地のために、一晩成長中に非常に劇的に変化することができるので、我々は、多くの場合、緩衝培地で細胞を増殖し、我々は増殖培地のpHは液胞のpH応答³に影響^を与えることができることを見出した。多くの実験がバッファリングされていない培地で細胞を成長させるためにしかし、それはまた、許容可能である。 図1Aは、上記のプロトコルでBCECF-AMと共にインキュベートした細胞の検量線を示す図である。 BCECF蛍光比と液胞のpHとの関係は広いpH範囲⁷にわたって非直線であるが、これらの実験の測定値に関連する範囲ではほぼ線形であり、線形近似曲線を示し、実験のためにpH値を計算するために使用される。 GLから生じる液胞pH変化グルコース欠乏細胞にucose添加は、 図1Bに示されている。細胞が奪われ...

ディスカッション

我々は、pHホメオスタシスの態様の数に対処するために、これらのプロトコルを利用している。例えば、我々は^、4,5野生型およびV-ATPアーゼ欠損変異体細胞の細胞質およびpH応答を比較した。我々はまた、グルコース^、3〜胞のpH応答に改変された成長条件、特に外pHの影響を調べた。重要なことは、我々が観察応答が量的pH測定する他の方法と、プロトンポンプ活動の変化を説明する生化学的データと一致している。

ここで説明する生体内のpH測定でのタイプの2つの最も重要な特徴は、蛍光体と信号のレベルの局在です。特定のアプリケーションまたは変異体のための方法、これらの要請修正のいずれかの問題。 BCECFの液胞の局在は⁶幾分偶然であるが、異なる変異体の数が保持され、含む液胞加水分解のレベルを減少させたVMA変異体^4。酵母液胞はノマルスキー光学顕微鏡下で容易に可視化であり、我々は各株のための染料の液胞の局在を確認する。 pHluorinは特に生理的pH範囲（ 図2A）...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
分光蛍光光度計	堀場製作所 ジョビン・イヴォン	型 フルオロマックス-4	温度制御と攪拌能力が望ましい。
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	乾燥DMSOに12 mMストックを調製し、-20°Cでアリコートとして保存します。C
モネンシン	シグマ	M5273	有毒。
ニゲリシン	シグマ	N7143	有毒。
MES	シグマ	M8250