Summary
מודל עכברי של ריפוי פצע עורי שניתן להשתמש כדי להעריך את התרכובות טיפוליות בהגדרות פיסיולוגיות וpathophysiological.
Abstract
ריפוי פצע ותיקון הם התהליכים הביולוגיים המורכבים ביותר המתרחשים בחיי אדם. לאחר פציעה, מסלולים ביולוגיים רבים להיות מופעלים. ריפוי פצעים לקוי, אשר מתרחש בחולי סוכרת לדוגמה, יכול להוביל לתוצאות חמורות שליליות כגון קטיעה. יש, אם כן, תמריץ להגדיל לפתח סוכני רומן המקדמים תיקון פצע. הבדיקות אלה היו מוגבלות למודלים של בעלי חיים גדולים כמו חזירים, שהם לעתים קרובות לא מעשיים. עכברים מייצגים את המודל האידיאלי קליני, כפי שהם חסכוני ונוחים למניפולציה גנטית, המאפשרת לחקירת מכניסטית. עם זאת, ריפוי פצעים בעכבר הוא שונה בהמהות לזה של בני אדם כפי שהוא מתרחש בעיקר דרך הצמצום. המודל העכברי שלנו מתגבר על זה על ידי שילוב של קיבוע באזור הפצע. על ידי קיבוע הפצע, תהליך התיקון הוא לאחר מכן תלוי באפיתליזציה, התרבות תאים ואנגיוגנזה, אשר משקפות באופן הדוקתהליכים ביולוגיים של ריפוי פצע אדם. בעוד הדורש עקביות וטיפול, מודל עכברי זה אינו כרוך בטכניקות כירורגיות מסובכות ומאפשר בדיקות חזקות של חומר מבטיח שעשויים, למשל, לקדם או לעכב אנגיוגנזה דלקת. יתר על כן, כל עכבר פועל כשליטה שלה כמו שני פצעים מוכנים, מה שמאפשר את היישום של שניהם במתחם ומבחן השליטה ברכב באותו בעל חיים. לסיכום, אנו מדגימים מודל מעשי, קל ללמוד, וחזק של ריפוי הפצע, שהיא דומה לזו של בני אדם.
Introduction
ריפוי פצע לקוי אחראי לתחלואה ותמותה בעולם משמעותית, זה נכון במיוחד עבור הסובלים מסוכרת 1,2. בבני אדם, ריפוי פצע הוא רצף של תהליכים, שבו יש חפיפה משמעותית 3. מייד התהליכים דלקתיים, פציעה הבאות הם יזמו. תאים דלקתיים לשחרר גורמים המעודדים את התהליכים של תא התפשטות, הגירה ואנגיוגנזה. לאחר היווצרות רקמה חדשה epithelialization מחדש ויש שלב של שיפוץ שכרוך גם אפופטוזיס וארגון מחדש של חלבוני מטריצה כגון קולגן.
המורכבות של ריפוי פצע לא יכולות כרגע להיות משוכפלת במבחנה וזה מחייב שימוש במודלים של בעלי חיים. נכון להיום, לימודי ריפוי פצעים היו מוגבלים למודלים של בעלי חיים גדולים, כמו חזירים, על מנת להבטיח כי תהליכי הריפוי הם שווי ערך ודומים לבני אדם. עם זאת, שימוש האנימה גדולהLS למחקרים מסוג זה יכול להיות קשה לבית והם לא תמיד מעשיים 4. עכבר המעבדה מייצג מודל חיה חסכוני, שניתן בקלות מניפולציות גנטית לחקירת מכניסטית 5-7. עם זאת, פצעים עכבריים לרפא בצורה שונה לאדם ב, בעיקר בשל התהליך של התכווצות 8. מדובר בין השאר, בשל שכבה תת עורית נרחבת משורטטת שריר נקראת carnosus מרפד שהוא במידה רבה חסר בבני אדם. בעכברים, שכבת שריר זה מאפשר לעור להעביר באופן עצמאי של השרירים העמוקים יותר והוא אחראי להתכווצות המהירה של הפציעה הבאה עור.
כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להתאים את ריפוי פצע עכברי לשכפל ריפוי פצע אדם על ידי שימוש בסד (איור 1) 8,9. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את המודל העכברי הפצע החורץ שמבטל התכווצות פצע והדוק יותר קרובות לתהליכים האנושיים של מחדש epithelialization והיווצרות רקמה חדשה. במודל זה שני חתכים בעובי מלא הכוללים carnosus מרפדים נוצרים על dorsum, אחד בכל צד של קו האמצע של העכבר. סד סיליקון ממוקם סביב הפצע עם הסיוע של דבק ולאחר מכן הקיבוע מאובטח עם תפרים. כל עכבר משמש כשלט משלו, עם פצע אחד מקבל טיפול ושליטה ברכב האחר, ובכך להפחית מספרים של בעלי חיים. בעקבות יישומים אקטואליים, הלבשה אוטמת שקופה מוחלת. ניתן להסיר את החבישה בעת צורך ליישומים נוספים אקטואליים ו / או מדידה של אזור הפצע 10,11. בהשלמת ניסויים, סגירת פצע, אדריכלות ומידת neovascularization המורפולוגי ניתן להעריך על ידי אימונוהיסטוכימיה. זה גם יכול להיות מנוצל חסכוני וקל לביצוע מודל להערכת ריפוי פצע בהקשר של סוכרת או pathophysiologies האחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת סדים ותחבושות occlusive
- מדורג 10 מ"מ חוגים ביריעות סיליקון בעובי 0.5 מ"מ ומספריים שימוש או ביופסיה כדי ליצור דיסקי סיליקון.
- מרכז מ"מ ביופסיה 5 באמצע מעגל 10 מ"מ ולחץ בחוזקה כדי ליצור חור ליצירת "סופגנייה", כמו דיסק שישמש כסד.
- מדורג 10 מ"מ על עיגולים שקוף הלבשה אוטמת כגון Opsite ומספריים להשתמש כדי ליצור תחבושות מעגליות.
2. חיות ניסוי
- השג אישור ועדת אתיקה לבעלי חיים כל הניסויים שיבוצעו.
- השתמש בעכברים ממין זכר C57BL/6J 8 שבועות ישנים (22-26 גרם) ממגדל מסחרי (למשל מעבדות ג'קסון).
- שמור על עכברים בתנאים סטנדרטיים של 21 מעלות צלזיוס ומחזור 12 שעות אור בחושך עם גישה החופשית למזון ומים.
- (אופציונלי): סוכרת יכולה להיגרם ב6 עד 7 עכברים ישנים שבוע על ידי בולוס intraperitoneal injection של 165 מ"ג / ק"ג streptozotocin (בחיץ ציטרט, pH 4.5), עם היפרגליקמיה אושר על ידי ניטור רמת סוכר בדם רגיל (AccuChek Glucometer). עכברים סוכרתיים עשויים להיות polyuria וכן המצעים שלהם ייתכן שיהיו צורך לשנות בתדירות גבוהה יותר כדי למנוע רטיבות והמשקולות שלהם צריכים להיות תחת פיקוח הדוק.
3. הרדמה והכנה אופרטיבית
- לגרום להרדמה כללית באמצעות 5% isoflurane ב 100% חמצן (קצב זרימה 1 ליטר / דקה) ולשמור על הרדמה באמצעות 1-3% isoflurane.
- להבטיח את הרפלקסים פדלים העמוקים של העכבר מדוכא ומניח את העכבר בעמדה פגיע.
- הכן את אזור הניתוח על ידי הסרת פרווה עם קוצץ מבסיס הצוואר עד 3 ס"מ בהמשך הגב ובין השכמות שתי כתפיים.
- יישום אור הקרם מקריח יכול להיות מיושם על לא יותר מ 2 דקות. מטליות גזה רטובות יכולות לשמש כדי להבטיח את כל השמנת ופרווה שנותרה מוסר.
- לנגב את העור עםספוגית אלכוהול ושני יישומים של 10% povidone-יוד (פולידין) ולעטוף את העכבר.
4. כריתה וקיבוע של פצע
- ייצוג בתרשים של מודל ריפוי פצעים העכברי מוצג באיור 1.
- השתמש סטרילי 4 מ"מ ביופסיה להתוות שתי תבניות עגולות לפצע משני צדי קו האמצע של העכבר ברמה של הכתפיים (ראה איורים 2a-2b).
- שימוש במלקחיים משוננים להרים את העור באמצע המתווה והמספריים איריס כדי ליצור פצע בעובי מלא המשתרע דרך הרקמה התת עורית (איורים 2 ג-2D), כולל carnosus מרפדים (2E איור), והבלו פיסה העגולה של רקמה.
- חזור על התהליך עבור הפצע בצד השני של קו האמצע (איור 2F).
- הסר ציפוי מגן פלסטיק מכל צד של סד סיליקון.
- החל cyanoacrylate דבק (למשל דבק סופר או דבק מגע דבק) בצד אחד של סד סיליקון.
- מרכז סד על הפצע (איור 2G) ועוגן הסד עם 6-0 תפרי ניילון הופסק כדי להבטיח מיצוב (איור 2H).
- חזור על תהליך קיבוע על פצע האחר.
- אם יש צורך בנקודת הזמן זו, להחיל המתחם הטיפולי להיבדק (μl עד 100) לפצע אחד (איור 2i), ושליטה ברכב לצד השני.
- לכסות את הפצע עם תחבושת אוטמת שקופה (לדוגמה, OpSite) (איור י 2-2k).
- שליט ממוקם מתחת לסדים ונלקח photomicrograph (איור 2L).
6. ניהול לאחר ניתוח
- Carprofen (5 מ"ג / ק"ג) אחת ליום מנוהל באמצעות הזרקה תת עורית-להקלה על כאב שלאחר הניתוח.
- אחרי החיות הניתוח הן בכלוב בנפרד ושמרו על חום מ 'ATS עד התאושש באופן מלא.
- לפקח חיות פעמיים ביום למשך גילויים של כאב וירידה במשקל. הבחנו לא מוצג התנהגות בוטה של כאב או ירידה במשקל.
7. מדידת פצע וטיפול
- הפצע יכול להימדד מדי יום.
- לגרום להרדמה כללית באמצעות 5% גז isoflurane (זרימת שיעור 1 ליטר / דקה), ולאחר מכן להבטיח את הרפלקסים התחושתיים העמוקים של העכבר מדוכאת באמצעות 1-3% isoflurane.
- בעדינות לקלף את רוטב occlusive עם מלקחיים.
- השתמש מחוגה כירורגיות כדי למדוד את קוטר הפצע. אנחנו לוקחים את הממוצע של שלוש מדידות לאורך X, Y ו-Z הציר (איורים 2 מ-2o), כמו גם photomicrograph לשימוש עתידי (איור 2).
- אופציונלי: בשלב זה את החיה ניתן להעריך לזלוף הדם באמצעות לייזר דופלר imager (איור רבעון 2).
- יישום מחדש של המתחם הטיפולי ושליטה ברכב יכול להיות ביצועיםתרופה בשלב זה.
- הלבשה אוטמת שקופה נקיות היא מחדש מיושמת ואת החיות כל הזמן חם עד שהתאוששו באופן מלא.
- הערה: אם סדים אינם מאובטחים כראוי את הפצע בקלות יהיה חוזה (איור 2 יח).
8. ניתוח היסטולוגית
- להרדים את העכברים לאחר 10 ימים עם מנת יתר של הרדמה.
- בעזרת מלקחיים ולהב סכין מנתחים להסיר את התפרים ובזהירות לקלף את הקיבוע.
- השתמשו במספרי איריס ליצור כריתה רחבה, מלאה מסביב ומתחת לאזור הפצע ודגירת הרקמות בparaformaldehyde 4% בופר פוספט (PBS) בשעה 4 ° C למשך הלילה.
- העברת רקמות לסוכרוז 17% בפתרון PBS עבור 24 שעות נוספות על 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להסיר פתרון עודף על ידי מספיג בזהירות על רקמות ומקום במתחם והקפאת אוקטובר ב -80 ° C.
- Hematoxylin ומכתים eosin יכולים לשמש כדי לחזות את המבנה ופער פצע אפיתל. Neovascularisation ניתן להעריך על ידי מנתח immunohistochemical כדי לקבוע את מספר הנימים (באמצעות גורם Willebrand פון).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עקומת סגירת פצע נקבעה על ידי חישוב הקוטר הממוצע של הפצע ולבטא את התוצאות באחוזים, כלומר 100 - (יום 0 קוטר / קוטר X יום). בניסוי זה מתחם טיפולי (או שליטה ברכב) יושם יומי לפצע. המתחם הטיפולי סגירת פצע מאוד מואצת (איור 3). חשוב לציין כי הסדים חייבים להישמר לתקופת הניסוי, כהסרת סדים תוביל להתכווצות פצע מהירה (איור 2 יח) ולסטות מהדפוס של ריפוי הפצע נצפה בבני אדם.
איור 1. הייצוג סכמטי של המודל העכברי ריפוי הפצע. במודל זה שני פצעי עובי מלאים נוצרים על eiיס צד של קו האמצע ומאפשר לכל עכבר כדי לשמש כשליטה שלהם. סדים סיליקון הם דבקו ונתפרו למתחם הפצע כדי למנוע התכווצות פצע, מתן מודל לשכפול לזה של בני אדם.
איור 2. ניתוח ריפוי פצעים ומדידות לאחר ניתוח. בעקבות הסרת שיער ובהכנה של העור עם יוד ואלכוהול (AB) אגרוף ביופסיה משמש עדינות לשרטט שני עיגולים בdorsum, משני צדי קו האמצע. (ג) חתך קטן לאחר מכן נוצר ו( ד) פיסה עגולה של עור הוסר, (ה) הכולל את carnosus panniculosus, (ו) כדי ליצור שני פצעי עובי מלא. (ז) דבק מוחל אז לsilic אחד סדים והסדים דבקו היקפי הפצע. (ח) סדים אז מובטחים עם תפרים. (I) טיפולים למריחה על עור ו( JK) הלבשה אוטמת, שקופה מושם על הפצע ודבקו בסדים (דבק יכול לשמש במידת צורך). (L) Photomicrographs נלקח מדי יום ואזור הפצע מחושב מהממוצע של שלוש מדידות על קוטר (מ ') ציר y, (n) וציר x (O) Z-הציר. (עמ' ) תמונה מייצגת את הפצעים ביום 10, וציין את הפצע הקטן בצד הימין שטופל במתחם טיפולי. (Q) תמונת דופלר לייזר נציג של זלוף של פצע הדם ביום 6. (R) דוגמה של פצע מהיר התכווצות בעקבות הסרת הסדים סיליקון.
65/50265fig3.jpg "alt =" איור 3 "עבור: תוכן-width =" 4in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
איור 3. גרף סגירת פצע נציג. אזור הפצע מחושב מהממוצע של שלוש מדידות בקוטר יומיות לאורך X, Y ו-Z-צירים. סגירת פצע מבוטאת כאחוז מאזור הפצע הראשוני ביום 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זהו מודל עכברי ניסויי של ריפוי פצע עורי. תכונה משמעותית של מודל זה היא השימוש בסדי סיליקון כדי למנוע התכווצות פצע כך שהיווצרות הרקמה חדשה epithelialization מחדש ועלול להתרחש, מה שהופך אותו דומה לתהליך המתרחש בבני אדם. מודל זה הוא תכליתי וניתן להשתמש בו כדי להעריך את ריפוי פצע (למשל בסוכרת) הגדרות הן פיסיולוגיות וpathophysiological. המודל עשוי לשמש גם כדי להעריך את פוטנציאל ריפוי פצע או הרפוי אנגיוגנזה בהגדרה חסכונית. עם כל עכבר מתנהג כמו שליטה משלו, מספרי בעלי החיים הם מזעריים. בטכניקות הכירורגיות הנדרשות למודל זה הן לא מאוד מתוחכמים, ובכך מודל זה יכול להיות בשימוש נרחב על ידי בעלי הניסיון ניתוחי קטן יחסית.
כדי להבטיח שחזור מדויק וכימות זוהי חובתו של הסד הוא דבק כראוי ומעוגן לעור עם תפרים, ושלאכאן הוא עיכוב מינימאלי בין יצירת שני בפצעים. הנטייה של פצעים עכבריים להתכווץ ההתרופפות הבאה של הסרת הסד או חלקי עקב גירוד על ידי העכבר דורש ניטור יומיומי של הסדים במהירות. יישום זהיר של דבק נדרש גם כדי למזער את הגירוי של עור בריא סביב הסד שעשוי לקדם את הגירוד. כמו כן, חשוב מאוד לעקוב אחר טכניקות אספטיים ויסודיות לחטא ציוד, במיוחד מחוגה, בין עכברים. היישום של ההלבשה האוטמת גם יש לקחת בחשבון, במיוחד אם פצעים לא הולכים להיות מטופלים או לבוש יומיומי. Opsite וTegaderm (3M) תחבושות הן להשוות 12, וזה הוכח כי חבישת Tegaderm עשויה להישאר דבקה במשך 1-2 ימים בלבד. צריכה פצע תחבושות לטווח ארוך יותר יידרשו גישה חלופית שתוארה על ידי צ'ונג ועמיתיו 13.
חולשות פוטנציאליות של מודל זה עשויות לכלול דלקת ד UE לעיגון של תפרים, דיפוזיה של הטיפול או ברכב בין הפצעים והכניסה של הטיפול למחזור הדם המערכתי. בכל הקשור לתפרי גרימת דלקת מקומית, התפרים ממוקמים יחסית רחוק מהפצע וכמו כל פצע שנוצר אותו הדבר, ולכן כל דלקת שעלולה להתרחש צריך להיות דומה בין פצעים. כמו כן, המרחק בין את הפצעים וחוסר הבצקת בין הפצעים היה למזער דיפוזיה בין שתי המיטות. ישנן עדויות כי טיפול עשוי להיכנס למחזור המערכתי, אשר עשוי להאיץ את הריפוי של פצע השליטה 9,10. כדי לקבוע את מידת טיפול הזנת מחזור המערכתי, עכברי littermate יכולים להיות מנוצלים, שבו הם התייחסו רק שני הפצעים עם הרכב. ההבדלים בשיעורי סגירת פצע בין עכברים שטופלו עם רכב בלבד, והעכברים שקבלו גם רכב וטיפול לאחר מכן ניתן להשוות.
"> לסיכום, יש לנו הפגנו מודל עכברי פשוט יחסי של ריפוי פצע שמציג רבים מהתכונות שנצפו בריפוי פצעים אנושי.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לתמיכת מימון הבריאות הלאומית והמועצה למחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה (פרויקט גרנט ID: 632,512). לואיז דאן נתמכה על ידי מלגת קריירה מוקדמת NHMRC וכריסטינה Bursill על ידי מלגת קריירה קרן לב לאומית לפיתוח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y.
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
- Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
- Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
- Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618 (2011).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
- Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
- Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).
